【摘 要】
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利用RT-PCR法,从人胰腺组织扩增出SNAP25基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体获得重组质粒pENTR/D-TOPO-SNAP25。经PCR及测序验证其阅读框正确。再与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DEST发
【机 构】
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中国科学院研究生院生命科学院,北京大学人民医院,首都医科大学公共卫生与家庭医学学院
【基金项目】
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国家自然科学基金(30670778);人事部留学回国人员科技活动择优课题;北京市优秀人才专项资助D类项目(20061D0501800254);高等学校博士学科点专项科研基金(20050025002)资助项目
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利用RT-PCR法,从人胰腺组织扩增出SNAP25基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体获得重组质粒pENTR/D-TOPO-SNAP25。经PCR及测序验证其阅读框正确。再与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DEST发生LR重组反应,SNAP25取代pAD/CMV/V5-DESTTM中的ccdB-CmR基因,获得重组腺病毒载体pAD/CMV/V5-DEST-SNAP25(pAD-SNAP25)。重组腺病毒载体经PacI酶切,脂质体法转染HEK-293A细胞.以鼠抗人SNAP25单克隆抗体为一抗,做荧光及Westernblot检测,结果表明重组腺病毒pAD-SNAP25在HEK-293A细胞中包装成功。重组腺病毒pAD-SNAP25感染大鼠胰岛,结果表明在高糖浓度下,外源性SNAP25蛋白的表达促进了大鼠胰岛素分泌。
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