泛素连接酶TRIM17相互作用蛋白的组学鉴定及其在端粒稳定性调控中的功能研究

来源 :李雪凤 |
研究背景及研究目的:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)主要参与真核细胞内一半以上的蛋白质降解。E3泛素连接酶被认为是决定泛素-蛋白酶体途径特异性的重要组成成分。根据其与底物蛋白结合的分子机制
研究背景及研究目的:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)主要参与真核细胞内一半以上的蛋白质降解。E3泛素连接酶被认为是决定泛素-蛋白酶体途径特异性的重要组成成分。根据其与底物蛋白结合的分子机制和其结构的不同,E3泛素连接酶可以分为三大亚类:HECT(Homology to E6-AP Carboxyl Terminus)结构域家族E3泛素连接酶、RING(Really Interesting New Gene)结构域家族E3泛素连接酶、RBR(RING-Between-RING)结构域家族E3泛素连接酶。其中,RING结构域家族泛素连接酶是种类最多的E3泛素连接酶家族。TRIM17(The tripartite motif 17)从属于 TRIM(The tripartite motif)蛋白家族,这是最大的 RING结构域E3泛素连接酶家族之一。目前已知的TRIM17的生物学功能主要有调控基因转录、蛋白质稳态、自噬发生、细胞凋亡,维持先天性免疫功能,促进或抑制肿瘤发生发展等。本实验室通过比较基因组学手段系统分析发现了TRIM17基因在地下长寿物种裸鼹鼠(Heterocephalus glaber,NMRs)和盲鼹鼠(Spalax galili,BMRs)中丢失。有文献报道TRIM17在鲸类和穿山甲中也丢失。这些物种的共同点特之一是长寿,因此我们猜想TRIM17可能有其他未发现的生物学功能,如调控长寿。端粒的稳定性是决定细胞寿命的关键因素。端粒是在细胞染色体末端部分像帽子一样的特殊结构,细胞每分裂一次染色体末端的端粒重复序列就要丢失50-100个碱基,丢失碱基后端粒会变短。当端粒变短到无法保护染色体末端时,细胞会停止分裂,继而发生衰老和死亡,细胞寿命缩短。本论文主要通过鉴定TRIM17相互作用蛋白,从中探索TRIM17是否影响长寿,并探索其作用的潜在机制。研究方法:在HEK293T细胞中过表达空白对照和TRIM17质粒,然后收集细胞裂解液进行免疫沉淀,获得TRIM17及其相互作用蛋白。接着,将纯化的TRIM17相互作用蛋白样品通过SDS-PAGE分离,银染观察特异性相互作用蛋白条带。再经过切胶、胰酶酶解得到肽段,然后样品进行除盐等处理后进行质谱检测。通过数据库搜索、定量分析和生物信息学网络的分析获得TRIM17相互作用蛋白及其参与的主要功能,再通过免疫沉淀和免疫印迹实验验证TRIM17的部分相互作用蛋白。我们在对照组和实验组细胞中加入蛋白酶体抑制剂处理和泛素化等实验验证TRIM17对其相互作用蛋白稳定性和泛素化的影响。我们尝试探究TRIM17及其相互作用蛋白参与的生物学功能及分子机制。另外,我们通过Q-FISH(Quantitative Fluorescent Hybridization)技术和端粒酶活性 TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocal)实时定量检测技术检测了 TRIM17 对端粒和端粒酶稳定性的影响。研究结果:在HEK293T细胞中通过免疫纯化和非标记定量蛋白质组学方法成功鉴定到了 TRIM17的相互作用蛋白,三次生物学重复实验鉴定了 30个有统计差异的TRIM17潜在相互作用蛋白。生物信息学分析显示TRIM17的相互作用蛋白主要参与端粒的稳定性调控、端粒定位以及蛋白质的折叠、定位、运输等生物学过程。生化实验发现TRIM17能下调其相互作用蛋白CCT1(T-complexprotein 1 subunit,TCP-1)的蛋白水平。蛋白酶体抑制剂处理和泛素化实验发现TRIM17过表达降低了 CCT1的稳定性,并且增强了 CCT1的泛素-蛋白酶体降解。通过Q-FISH技术和端粒酶活性检测我们还发现TRIM17影响端粒和端粒酶的稳定性。研究结论:通过免疫沉淀和定量蛋白组学相结合的方法,我们鉴定到了 30个TRIM17的相互作用蛋白,进一步发现了 TRIM17下调相互作用蛋白CCT1的水平和促进CCT1的泛素-蛋白酶体降解,影响端粒和端粒酶的稳定性。这一结果丰富了我们对TRIM17的生物学功能的认识,同时也为后续探索TRIM17潜在生物学功能和机制研究提供了实验依据。
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