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蛋白质磷酸化修饰在细胞生命活动中具有重要的调控作用,参与信号传导、代谢和凋亡等关键生物学过程。由于多磷酸化肽离子化效率低、磷酸根容易丢失等原因,鉴定多磷酸化位点仍然遇到较大的困难。我们建立了分步富集单磷酸化和多磷酸化肽的方法,CATSET(Citric acid-assisted twostep enrichment with Ti O2),并应用于He La细胞和大鼠胚胎神经干细胞的磷酸化蛋白质组研究,结合SILAC定量方法对磷酸化蛋白质的动态修饰进行了初步研究。Jensen等人发现在高浓度的柠檬酸中只有多磷酸化肽与Ti O2填料具有较强的结合能力[1]。因此我们在高浓度柠檬酸条件下富集多磷酸化肽,而在低浓度柠檬酸条件下富集单磷酸化肽,从而实现多磷酸化肽和单磷酸化肽的分步富集。在1mg He La细胞酶解物中,高浓度柠檬酸(1 M)组分中鉴定出1033个多磷酸化肽,占所有磷酸化肽的69%。在低浓度柠檬酸(50 m M)组分中鉴定出1989个单磷酸化肽,占所有磷酸化肽的92%。与常用的DHB(2,5-dihydroxy benzoic acid)方法相比[2,3],CATSET方法鉴定的多磷酸化肽的数量要多出2.6倍。结果证明CATSET方法有效地提高了多磷酸化肽段的鉴定率,可在大规模的磷酸化蛋白质组研究中得到广泛应用。结合SCX预分级,我们在He La细胞中鉴定出15713个磷酸化位点,其中多磷酸化肽占所有磷酸化肽的比例接近40%(图1)。我们建立了多磷酸化肽和单磷酸化肽分步富集的CATSET方法,大大提高了多磷酸化肽的鉴定效率,并且可以应用于细胞或组织等大规模磷酸化蛋白质组研究中。