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背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一。近年研究发现肾小管病变在糖尿病肾病发生、发展中起重要作用。肾小管需要大量的能量及氧供应以维持代谢,富含大量线粒体,是能量代谢最为活跃的组织之一,因此一旦线粒体功能障碍,势必影响肾小管功能。线粒体融合-分裂的动态平衡对线粒体功能的维持至关重要,因此线粒体动力学异常在DN中的作用越来越引起人们的注意。最新的循证医学实验如EMPA-REG研究,CREDENCE研究等表明,恩格列净(Empagliflozin,Empa)、卡格列净(Canagliflozin,Cana)等钠葡萄糖共同转运体 2(Sodium glucose co-transporter 2,SGLT2)抑制剂可以显著延缓糖尿病肾病进展,而且这种改变独立于药物降糖作用以外,因此SGLT2抑制剂的肾脏获益越来越引起人们的兴趣。有文献报道,Empa可以减轻心脏微血管内皮细胞的线粒体分裂,从而改善糖尿病心肌病变。Empa的肾脏保护作用,是否与抑制肾脏线粒体分裂有关目前仍不得而知。目的:以糖尿病肾病的动物模型及肾小管上皮细胞为研究对象,验证磷酸甘油酸变位酶家族成员5(Phosphoglycerate Mutase 5,PGAM5)在线粒体分裂及糖尿病肾病发生发展的作用;探讨Empa可能通过激活AMPK,降低PGAM5,进而减轻线粒体分裂,改善糖尿病肾病的可能机制。方法:动物试验1.以自发2型糖尿病小鼠(KK-Ay小鼠)为研究对象,给予高脂饮食喂养,在糖尿病小鼠出现微量尿白蛋白时,即认为糖尿病肾病模型成立。8周龄KK-Ay小鼠30只,随机分为(1)KK-Ay组:未治疗的2型糖尿病KK-Ay小鼠(n=15);(2)Empa 组:KK-Ay 小鼠每天给予 Empa(3.8mg/kg/d),(n=15)。(3)C57组:将健康同龄C57BL/6J小鼠设为对照组n=(15)。2.3组小鼠均饲养8周。实验终点处死小鼠后,检测小鼠体重、血糖、胰岛素、尿NAG、尿NGAL及24小时尿微量白蛋白变化;检测肾组织中HE染色,细胞凋亡、线粒体分裂的变化采用Western Blot法检测肾组织中PGAM5、AMPK、SP1及线粒体分裂相关蛋白的变化,初步探讨Empa改善糖尿病肾小管损伤的机制。细胞实验3.体外试验以人肾近端小管上皮细胞(HK-2细胞)为研究对象,分为正常糖组(NG)、高渗对照组(MA)、高糖刺激组(HG)及高糖+Empa组(HG+Empa)。4.Mito-tracker染色观察线粒体形态变化,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,Western Blot分别检测细胞凋亡、线粒体动力学相关蛋白以及p-AMPK、SP1、PGAM5的变化;5.分别应用Empa、AMPK激活剂及AMPK抑制剂验证Empa在高糖条件下通过AMPK/SP1/PGAM5通路改善肾小管损伤的机制;应用RNA干扰技术,分别下调PGAM5及SP1观察SP1、PGAM5在糖尿病肾小管损伤中对线粒体动力学、细胞凋亡的影响,明确SP1与PGAM5的上下游关系;6.通过双荧光素酶报告试验及CHIP试验,验证SP1与PGAM5启动子区的相互作用。结果:1.与正常对照组小鼠相比,KK-Ay组小鼠肾小管扩张,空泡样变性,肾小管损伤标志物及肾小球损伤标志物显著增加;细胞凋亡增加;Empa组小鼠HE染色提示肾小管扩张及空泡样变性改善,肾小管损伤标志物及肾小球损伤标志物显著减少,细胞凋亡减轻。2.KK-Ay组小鼠肾脏组织中DRP1S637表达减低,Mito-DRP1表达增加,Empa组小鼠肾脏组织中DRP1S637表达增加,Mito-DRP1表达减少。KK-Ay组小鼠肾脏组织中p-AMPK表达降低,SP1、PGAM5表达增加;Empa组小鼠p-AMPK表达增加,SP1、PGAM5表达降低。3.高糖培养的HK-2细胞中细胞凋亡增加,加入Empa以后,细胞凋亡减轻。4.高糖培养的HK-2细胞中DRP1S637表达降低,Mito-DRP1表达增加,Mito-tracker染色提示线粒体形态变圆,变短,JC-1染色提示线粒体膜电位下降,加入Empa以后,DRP1S637表达增加,Mito-DRP1表达减少,Mito-tracker染色提示线粒体形态变长,JC-1染色提示线粒体膜电位升高;高糖培养的HK-2细胞中p-AMPK表达降低,SP1、PGAM5表达显著增加加入Empa以后,p-AMPK表达增加,SP1、PGAM5表达显著下降。5.在高糖培养的HK-2细胞中加入AMPK激活剂AICAR可以增加DRP1S637表达,同时p-AMPK表达增加,SP1、PGAM5表达降低,与Empa作用类似;在正常糖培养的HK-2细胞中加入AMPK抑制剂Compound C,DRP1S637表达降低,同时p-AMPK表达降低,SP1、PGAM5表达增加,与高糖干预HK-2细胞的表现类似加入Compound C以后,Empa对高糖培养的HK-2细胞 DRP1S637、p-AMPK、SP1 及 PGAM5 表达的影响消失。si-SP1 和 si-PGAM5均可以增加高糖培养的HK-2细胞中DRP1S637的表达,提示si-SP1和si-PGAM5均可以抑制线粒体分裂si-SP1还可以降低高糖培养HK-2细胞中PGAM5表达,但是si-PGAM5对SP1无作用;另外,无论si-SP1还是si-PGAM5,对p-AMPK表达均无影响。6.PGAM启动子区593位点是与转录因子SP1结合并发挥作用的主要位点;CHIP试验提示转录因子SP1可以和PGAM5的启动子序列结合,调控PGAM5的转录。结论:1、在糖尿病肾病中,AMPK磷酸化降低,引起SP1表达增加,SP1作为PGAM5的转录因子,增加PGAM5的转录,使DRP1S637去磷酸化增加,促进线粒体分裂,加重糖尿病肾小管损伤。2、Empa通过激活AMPK,减少SP1表达,降低PGAM5的转录,减少DRP1S637的去磷酸化及线粒体分裂,减轻糖尿病肾小管损伤,延缓糖尿病肾病进展。