【摘 要】
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[目的]大肠杆菌O157∶H7 (E.coli O157∶H7)引起的食物中毒是一种常见的动物食源性疾病.液相蛋白芯片技术主要是通过单抗和多抗的夹心ELISA或者竞争ELISA方法以实现对目
【机 构】
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军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨
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[目的]大肠杆菌O157∶H7 (E.coli O157∶H7)引起的食物中毒是一种常见的动物食源性疾病.液相蛋白芯片技术主要是通过单抗和多抗的夹心ELISA或者竞争ELISA方法以实现对目标分子的检测,实验过程(以夹心ELISA为例)包括单抗偶联微球、捕获靶分子、加入多抗、以及荧光标记的二抗等多个步骤,除此之外,方法中还涉及了多次重悬、洗涤等过程.本研究建立E.coli O157∶H7新型液相蛋白芯片技术,以实现对E.coli O157∶H7的快速检测.[方法]分离培养E.coli O157∶H7至OD600=1.0(约1×109 CFU/mL),甲醛灭活后PI染色,应用流式细胞术对染色细菌进行荧光强度的稳定性评价.同时,将E.coli O157∶H7单克隆抗体通过SMCC共价偶联技术偶联于微球,应用FACS Array对捕获微球的特异性和亲和性进行评价.[结果]细菌甲醛灭活条件：4‰终浓度,37℃ 30min.PI染色条件：100μg/mL、4℃下30min.应用流式细胞术对染色后的细菌进行不同时间段的荧光值测定,1.5h内荧光中值未发生显著变化且染色后的阳性细菌百分比始终处于95％以上.90μL 1mg/mL E.coli O157∶H7单克隆抗体与75μL荧光微球(约6×106个)进行偶联.在建立的方法中,微球使用量约3×104个,菌量在1×106CFU/mL～1×03 CFU/mL时,捕获微球呈现良好的特异性和亲和力.[结论]与常规液相蛋白芯片不同,该方法直接将染色后的菌体荧光作为报告分子,能够较为快速的实现对E.coli O157∶H7的检测.
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