【摘 要】
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氨基酸是人体重要的化合物,由于氨基酸需求量日益增加,氨基酸的生产尤为重要,其中利用微生物为宿主进行代谢调控在生产氨基酸等化学品方面起着越来越重要的作用。反式-4-羟基
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氨基酸是人体重要的化合物,由于氨基酸需求量日益增加,氨基酸的生产尤为重要,其中利用微生物为宿主进行代谢调控在生产氨基酸等化学品方面起着越来越重要的作用。反式-4-羟基-L-脯氨酸是存在于动植物胶原蛋白,细胞壁蛋白以及微生物次级代谢产物中的一种重要手性氨基酸,广泛用于药品合成,食品,化妆品添加剂和生物技术和生物化学等领域。本文在E.coli w3110敲除脯氨酸脱氢酶(put A)阻断了底物脯氨酸消耗的路径,敲除异柠檬酸裂解酶基因(ace A)和异柠檬酸激酶(ace K)阻断了乙醛酸循环,减少了底物酮戊二酸竞争路径,敲除基因琥珀酸脱氢酶(suc AB),引入外源脯氨酸-4-羟化酶(P4H),构建出了菌体生长和反式-4-羟基-L-脯氨酸生产相偶联的工程菌株,实现了利用外源葡萄糖和脯氨酸添加生产出反式-4-羟基-L-脯氨酸的目标。通过优化脯氨酸-4-羟化酶的表达载体,摇瓶发酵羟脯氨酸产量为1.08g/L。在分批发酵的过程中,温度30℃,PH为7.0,转速400rmp,DO 30%,最终反式-4-羟基-L-脯氨酸产量18.09g/。为解决工业发酵过程中诱导剂成本高等问题,在质粒上优化了四种表达强度不同的组成型启动子来启动外源脯氨酸-4-羟化酶表达,筛选出了OD和羟脯氨酸产量最高的M64组成型启动子。将外源P4H整合到染色体上,解决工业发酵过程中质粒丢失的问题。
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