托品烷类生物碱(TAs)是一类提取自茄科植物的次生代谢物,常用的药用产物包括莨菪碱和东莨菪碱。两者尤其是东莨菪碱具有很强的抗胆碱作用,作为镇静剂和麻醉剂广泛应用于临床上。随着对东莨菪碱药理作用研究深入,其新功能不断开发,在原有巨大市场基础上,需求量在迅速增长。东莨菪碱目前都是从天然植物中提取,包括颠茄、莨菪、曼陀罗等茄科植物。颠茄各部分均含莨菪碱(hyoscyamine,C17H2303N)及阿托品(atropine,C17H2303N) 等托品烷类生物碱,是东莨菪碱最主要的商业栽培药源,因而培育东莨菪碱高产的颠茄是东莨菪碱产业一直追求的一个目标。在过去的数十年中,研究人员采用脱毒、杂交育种、射线诱变等常规育种方法提高东莨菪碱的含量和产量,均没有取得显著成效。因而,采用新型研究策略,结合先进的技术改良颠茄势在必行。代谢工程技术将在培育东莨菪碱高产的颠茄中发挥决定性的作用。TAs 生物合成起源于多胺代谢途径,途径中多个基因目前已经被克隆得到,使 TAs 途径的代谢工程修饰有了可能。PMT 和 H6H 是催化 TAs 途径中的关键酶,目前已有报道证明这两个酶是 TAs 途径代谢工程的靶点。本研究选取 TAs 基源植物颠茄作为植物材料, 首先建立其离体培养体系、快速繁殖体系和基于发根的外源基因表达体系。将携带烟草 PMT 和莨菪 H6H 的 pXI 质粒转入经过"解除武装"的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) C58C1(携带 pRiA4质粒),获得工程菌株 C58C1-pXI。采用叶盘法转化颠茄无菌苗真叶(不带外源基因的空白 A4转化株作为对照)。经选择培养基初步筛选获得转双基因的转化发根, 对发根基因组进行 ro1C、NPT-Ⅱ、PMT、H6H 基因的 PCR 检测,确定了其整合情况。对转基因发根进行液体振荡培养,测定了不同单克隆发根的产量及其莨菪碱和东莨菪碱含量。其中 PMT、 H6H 双基因共转化的发根单克隆 T3东茛菪碱和莨菪碱的含量均最高,东莨菪碱含量为1.0 mg.g-1 DW,是 A4转化发根的6倍。野生植株的4倍;莨菪碱含量为2.2mg.g-1 DW,为 A4转化的发根提高8倍,野生型植株的24倍;RT-PCR 结果显示了外源基因在不同转化株中转录水平的表达情况。说明将 PMT 和 H6H 同时转入颠茄,可以促进颠茄代谢流向生成莨菪碱和东莨菪碱的方向流动。本研究采用多基因共转化调控策略成功实现了颠茄 TAs 途径的代谢工程, 为利用植物次生代谢工程技术实现颠茄托品烷类生物碱特别是东莨菪碱的代谢工程及开展分子育种奠定了坚实基础。