基于RNA-seq的马铃薯抗旱相关基因挖掘与分析

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中国的马铃薯播种面积和总产均居世界第一,但单产水平还远远低于发达国家。主要原因之一是,中国60%左右的马铃薯种植在干旱半干旱地区,产量无法保障。马铃薯又属于浅根系作物,对水分亏缺十分敏感,干旱会导致其减产甚至绝收。近几年来,中国马铃薯各主产区受干旱影响大幅度减产的情况越来越频繁。当前,研究者在马铃薯抗旱方面的研究主要针对生理和形态指标,而有关马铃薯对干旱胁迫响应的分子机制尚不清楚。随着现代分子生物学技术的发展,转录组测序技术在基因表达和调控方面的应用越来越广泛。随着马铃薯DM测序的完成,该技术在马铃薯干旱胁迫基因表达模式和调控方面的研究逐渐增多,但在复水后基因表达等方面的研究较少。因此,研究旨在通过对极端抗旱材料在干旱胁迫和复水后的转录组分析,深入研究马铃薯响应干旱胁迫的调控网络、解析马铃薯抗旱分子机制,为建立高效的抗旱分子育种改良技术和加快选育抗旱品种提供理论依据。试验以前期试验筛选出的极端抗旱品系"C93"为试验材料,于盆栽条件下,在块茎形成期对其进行干旱胁迫(5 d)和复水处理(4 h),并采集干旱胁迫后0,1,3和5 d和复水后1、4 h的功能叶片进行转录组分析,每个处理3次生物学重复。通过对测序数据进行过滤,共获得了1 781 990 986对clean reads,平均每个样品为53 999 726对,且平均每个样品的碱基正确识别率(Q30)为94%。各样品与马铃薯DM参考基因组的比对吻合率约86%,其中具有唯一位点匹配的吻合率为82.3%。说明测序质量较高,可以进行后续分析。为了进一步鉴定马铃薯叶片响应水分胁迫和复水应答过程中的基因表达模式,以各取样点的充分灌水为对照,分析干旱胁迫后不同阶段的差异表达基因,且设置FDR<0.05。若差异基因的变化倍数即log2foldchange>0视为差异基因上调,反之则为下调。随着干旱胁迫天数的增加,差异表达基因数量也增加,胁迫后1,3和5 d的差异基因数分别为550,4 216和5 974个,各点均表现为下调表达基因数量小于上调表达基因数。复水后差异基因数量也随着复水时间的延长而增加,复水后1和4 h的差异表达基因数分别为2 086和4 322个,在复水后1h下调表达基因数量明显大于上调表达的,但在4 h时上调表达的大于下调表达的。其中,在干旱过程中上调表达的基因数为1702个,复水后下调表达的基因数为1 889个。进一步筛选发现,在干旱过程中上调,复水后又下调的基因共56个。GO富集分析发现,56个基因中有47个基因获得了684个GO条目,其中显著富集的GO条目有104个。在前30个显著富集(P<0.05)的GO条目中,有9个与水分胁迫响应有关,分别为生物过程中的转录调控/DNA模板、核酸模板转录调控、RNA生物合成过程调控、RNA代谢过程调控;细胞组分中膜完整组成、膜和膜内在组成;分子功能中的信号受体活性、受体活性,这些GO条目共覆盖了62%的差异表达基因。KEGG途径分析发现,56个基因中有13个基因获得了12条KEGG途径注释,其中有2条途径被显著富集(P<0.05),分别为植物激素信号传导和蜡质,软木脂和蜡质生物合成,这两个途径共包含了8个差异表达基因。此外,与水分胁迫响应有关的光合作用天线蛋白也被富集。以上这些途径中富集基因与GO富集分析结果一致。根据BLAST结果对差异基因进行功能注释,发现有多个水分胁迫标志性基因显著表达,如胚胎晚期发育富集蛋白LEA、植物响应干旱胁迫ABA途径上的ABA合成限速酶NCDE、负调控ABA信号的植物蛋白磷酸酶PP2C及其下游转录因子b-ZIP,同时还有非ABA途径上的AP2/ERF转录因子及共同参与ABA和非ABA途径的转录因子HD-ZIPI;此外,茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和生长素(IAA)相关的基因在干旱过程中也显著表达。随机挑选8个基因进行qRT-PCR验证,结果与转录组测序结果一致,证实了转录组测序结果的可靠性。研究建立的马铃薯抗旱基因表达谱将为进一步揭示马铃薯抗旱分子机制和进行抗旱育种提供理论支撑。
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