【摘 要】
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目的:本实验拟进一步揭示LCMR1与DEK的结合区域,并借助相互作用蛋白DEK功能区提供的线索,开展LCMR1功能研究,探讨其在细胞凋亡中的作用及作用机制,为在基因水平预防和治疗肺癌寻找新的分子靶点,为抗癌药物的研发和肺癌治疗提供线索和分子基础。方法:构建DEK(N端)功能区质粒及DEK(C端)功能区质粒,使用TNT兔网织红细胞裂解液体系,在体外快速转录翻译DEK(N端)功能区蛋白及DEK(C端)
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目的:本实验拟进一步揭示LCMR1与DEK的结合区域,并借助相互作用蛋白DEK功能区提供的线索,开展LCMR1功能研究,探讨其在细胞凋亡中的作用及作用机制,为在基因水平预防和治疗肺癌寻找新的分子靶点,为抗癌药物的研发和肺癌治疗提供线索和分子基础。方法:构建DEK(N端)功能区质粒及DEK(C端)功能区质粒,使用TNT兔网织红细胞裂解液体系,在体外快速转录翻译DEK(N端)功能区蛋白及DEK(C端)功能区蛋白;应用大肠杆菌原核表达系统,以pGEX-5T质粒及pGEX-5T-LCMR1质粒为模板,诱导表达GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白;采用GST融合蛋白沉降(GSTPull-down)技术,研究LCMR1与DEK(N端)功能区、DEK(C端)功能区的结合情况,并借助DEK功能区提供的线索,初步推测LCMR1功能;采用小干扰RNA技术敲减LCMR1,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹方法,在mRNA水平及蛋白水平验证LCMR1下调效果;)采用流式细胞术及PI染色法,检测LCMR1下调后凋亡细胞数量的变化;采用Western Blot方法,检测LCMR1下调后细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8及caspase-9表达量变化;采用分光光度法检测LCMR1下调后细胞凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-8及caspase-9活性变化;采用qRT-PCR及Western Blot方法,检测LCMR1下调后细胞P53,Bax,Bid及Mcl-1 mRNA水平和蛋白水平变化。结果:成功构建DEK功能区质粒,并在体外成功转录翻译功能区蛋白;成功原核诱导表达并纯化GST蛋白及GST-LCMR1蛋白;通过GST pull-down实验证实,LCMR1与DEK(N端)功能区有相互作用,LCMR1与DEK(C端)功能区无相互作用;从mRNA水平和蛋白水平验证了设计的LCMR1小干扰RNA对LCMR1有明显的敲减效果;LCMR1与细胞凋亡关系研究发现,LCMR1下调导致:①凋亡细胞增加并出现明显凋亡峰;②活化的Caspase-3蛋白表达增加、活性增强。(6)LCMR1的凋亡机制研究发现,LCMR1下调导致:①活化的Caspase-8蛋白及活化的Caspase-9蛋白表达增多、活性增强;②肺腺癌A549(p53+/+)细胞凋亡增加,肺腺癌H1299(p53-/-)细胞凋亡无明显增加;③细胞P53蛋白表达增加;④促凋亡因子Bax及Bid表达升高,抑凋亡因子Mcl-1表达下降。结论:(1)通过GST pull-down实验证实LCMR1与DEK(N端)功能区有相互作用,根据相互作用蛋白DEK功能区的线索,推测LCMR1与细胞凋亡相关。(2)成功设计并选取LCMR1的小干扰RNA,并验证其对LCMR1有明显的敲减效果。(3)LCMR1下降可引起细胞凋亡增加,LCMR1与细胞凋亡负相关。(4)LCMR1同时参与内源性及外源性凋亡通路。(5)LCMR1依赖P53基因通路影响细胞凋亡。(6)LCMR1与Bax、Bid、Mcl-1凋亡相关基因密切相关,LCMR1通过Bcl-2家族基因调控细胞凋亡。
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