目的建立线粒体杂合突变的定量基因诊断技术平台,并对线粒体A3243G突变引起的早发型糖尿病样本开展定量基因诊断。方法为了鉴定PCR-RFLP、DNA测序、高分辨率熔解曲线(HRM)分析和焦磷酸测序(Pyro)技术等四种不同方法对线粒体杂合突变检测的准确度和灵敏度,我们先制备了线粒体3243突变的标准品(即用已知突变和未突变的质粒样本混合,得到一系列突变比例确定的混合液),然后用四种方法分别进行检测,确定各自的检测阈值。随后,我们从在上海市第六人民医院糖尿病研究所进行治疗的13个早发型糖尿病家系中共采集89例外周血样本(其中26个为患者配偶,无早发型糖尿病),抽提DNA后分别采用HRM和Pyro进行定量基因诊断分析。结果四种方法的对比实验结果发现Pyro的检测灵敏度和准确度最高,可对突变比例在0.5%以上的样本进行精确定量;HRM则可对突变比例2%以上的样本进行半定量分析。而PCR-RFLP和DNA测序仅能对突变比例10%以上的样本进行定性分析。早发型糖尿病样本的诊断结果发现在73例样本中检出了A3243G突变,最高杂合度达71.9%,最低杂合度为0.5%。26个患者配偶样本均未检出A3243G突变。结论我们建立了以焦磷酸测序和HRM技术为基础的点突变定量基因诊断技术平台,其中HRM技术费用较为低廉,可实现点突变的快速定量筛查。而焦磷酸测序技术可对线粒体杂合突变进行精确定量分析,两者具有较好的互补性。A3243G突变在线粒体相关的早发型糖尿病患者外周血中普遍存在,对其突变杂合度的定量检测将为疾病预后的判断提供依据。