骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于骨髓基质的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,能够诱导分化为肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和骨细胞等多种终末细胞.本试验以猪骨髓MSCs为试验材料,旨在建立体外分离、纯化猪骨髓MSCs并向成脂和成肌诱导分化的方法.选择5日龄长白小公猪,采用红细胞裂解法和Percoll密度梯度离心法,从猪的骨髓分离纯化了MSCs,采用免疫荧光染色和流式细胞仪检测获得的细胞是否具有MSCs的特性.取传代至第4代的猪骨髓MSCs,待细胞铺满瓶底约90％置丁成脂诱导液(50nmol/L胰岛素、50nmol/L地塞米松、50μmoL/L油酸、0.5mmol/L辛酸和5％胎牛血清的DMEM培养基)中诱导10天.另外,取第4代的猪骨髓MSCs,接种后第2天将细胞置于成肌诱导液(10μmol/L 5-氮杂胞苷、2.5ng/ml碱性成纤维细胞因子和2％马血清的DMEM培养基)中诱导,24h后,换成含有2.5ng/ml碱性成纤维细胞因子、1％鸡胚浸出液和2％马血清的DMEM培养基诱导48h,随后换成不含碱性成纤维细胞因子、但含有1％鸡胚浸出液和2％马血清的DMEM培养基继续诱导18天.两种诱导方法均利用PCR、免疫荧光染色或蛋白印迹的方法检测成脂或成肌相关基因及蛋白的表达情况.细甫种后24h开始贴壁,约8天长满单层,呈长梭形、三角或多角形.免疫荧光染色和流式细胞仪检测结果表明,获得的猪骨髓MSCs能够表达MSCs的表面标志CD29和CD44,而不表达CD31和CD45.成脂诱导结果表明,诱导第3天倒置显微镜下即可见少量小脂滴,随诱导时间延长,脂滴体积逐渐增大,数量也逐渐增多,至诱导后第10天,约70％细胞内含有脂滴,油红O染色阳性.PCR检测结果表明,诱导10天的细胞可表达成脂相关基因,包括PPARγ、C/EBP-α、PLIN、ACC、 SREBP1c,蛋白印迹结果表明,诱导10天的细胞可表达成脂相关蛋白,包括PPARγ、PLIN.成肌结果表明,5-氮杂胞苷诱导后,细胞有少量死亡；诱导后3～4天可见梭形样细胞；8～10天可见有少量肌管样细胞形成,随着诱导时间延长,可见肌管样细胞的数目逐渐增加；PCR检测结果表明,诱导后21天的肌管样细胞可表达成肌相关基因Myf5、Desmin和Myogenin；免疫荧光染色可见肌管样细胞呈Myf5、MyoD、Desmin、Myogenin和MHC阳性,Hochest复染后可见肌细胞内有多个细胞核.结果提示,本试验获得的猪骨髓MSCs符合骨髓MSCs的特性,并成功建立了体外诱导猪骨髓间充质于细胞向成脂和成肌细胞分化的模型.