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原花青素是一种复杂的黄酮类聚合物,是清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂。红葡萄酒中含有大量来源于葡萄果皮和种子中的原花青素。已有研究表明多种植物MADS-box基因Bsister(BS)参与调节种子中原花青素合成与积累,但调控机理尚不明确。本研究中克隆了葡萄BS基因,并分析其序列特征、表达模式,同时对它们的互作蛋白及下游调控基因进行筛选验证,以期进一步阐明葡萄种子中原花青素合成的调控机制。以‘黑比诺’葡萄(Vitis vinifera‘Pinot Noir’)为材料,通过RT-PCR方法克隆VviBS;实时荧光定量PCR技术分析VviBS的表达模式;构建VviBS-GFP融合蛋白并转化烟草叶片,观察其亚细胞定位;使用酵母双杂交和荧光双分子互补技术筛选验证VviBS蛋白的互作蛋白;并用酵母单杂交技术确定VviBS转录因子的下游调控基因。本研究中从葡萄中克隆得到3个VviBS,分别命名为VviBS1、VviBS2和VviBS3,对其所编码的氨基酸序列进行生物信息学预测,VviBS蛋白均具有保守的MADS(M)域、保守性较弱的中间(I)域、K域以及含有PI基序的C–末端。组织特异性表达分析结果显示,VviBS1和VviBS2主要在花、花蕾、胚珠(种子)中表达,而VviBS3只在葡萄卷须和穗轴中表达,这与典型的BS基因亚家族的表达特征不符,因此对VviBS3在不同种形态的卷须与穗轴中的表达模式进一步分析,结果显示VviBS3的表达水平与葡萄成花呈反相关;对在胚珠中特异表达的VviBS1和VviBS2分别在种子发育各个阶段的表达水平进行检测,结果显示VviBS1和VviBS2的表达量在种子发育初期处于高水平,随后迅速下降,并持续维持在较低水平,这与种子中原花青素的积累时间相互契合。亚细胞定位结果显示VviBS1、VviBS2和VviBS3蛋白都定位于细胞核中,这与其转录因子的功能相吻合。酵母双杂交和荧光双分子互补试验表明VviBS1和VviBS2蛋白与多个MADS-box家族蛋白互作,而VviBS3与这些蛋白并不互作,其功能可能产生分化。酵母单杂交试验结果表明转录因子VviBS1和VviBS2均与葡萄ANR基因启动子结合。VviBS1和VviBS2参与ANR基因表达的调控和原花青素合成还需进一步验证。