不同毒力NDV末端序列突变株反向遗传系统的建立

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前言新城疫病毒(NDV)基因组两端含有顺反子外片段,为3’端引导L eader序列和5’端尾随Traiiler序列,二者是病毒复制、转录、包裹的重要序列。为深入了解NDV末端序列的结构和功能,本研究拟利用前期构建NDV NA-1株反向遗传系统,将NA-1株的末端序列替换为La Sota株的末端序列,以探讨不同毒力异源NDV末端序列对毒力的影响。材料与方法(1)材料:NDV NA-1株由本实验室分离、保存;SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。(2)方法:引物设计:设计在病毒基因组cDNA5’末端和3’末端分别引入SalI和RsrⅡ两个限制性内切酶酶切位点及锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)序列。末端序列突变质粒构建:利用PCR技术,构建三株以鹅源强毒株NA-1全长感染性克隆pCI-NA-1为骨架,分别替换鸡源弱毒株LaSota的3’或5’UTR,以及3’和5’UTR均为LaSota相应序列的突变质粒。突变病毒株的拯救:采用磷酸钙法将已构建的3个突变感染性克隆分别与3个辅助质粒共转染。RT-PCR及测序鉴定:对替换序列进行PCR鉴定,并测序。电镜观察。结果与讨论(1)重组质粒测序鉴定:通过生物学软件DNAStar对替换后的末端序列进行比对分析,结果显示所替换的序列未出现基因突变现象,证明非编码区替换成功,获得3株突变全长感染性克隆pCI-rNA-L、pCI-rNA-T、pCI-rNA-LT。(2)重组病毒的拯救:将所获得的3株突变感染性克隆分别与辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞,4天后收获细胞上清,接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔,4天后收取鸡胚尿囊液,进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测,收获二者检测均为阳性的鸡胚尿囊液,分别命名为rNA-L、rNA-T、rNA-TL。(3)测序鉴定结果:通过RT-PCR鉴定,测序分析结果显示重组毒株替换部分序列未发生碱基突变。(4)电镜结果:电镜观察到具有典型副粘病毒科特征的、有囊膜的NDV颗粒。结论经鉴定成功构建了3株NDV NA-1末端序列替换突变株rNA-L、rNA-T及rNA-LT的反向遗传操作系统,为后期毒力分析奠定基础。
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