【摘 要】
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在自然环境中植物会受到各种各样的病原物威胁,为了抵抗病原物入侵,植物形成了极其复杂的防御系统,其中植物抗病基因(R基因)能够直接或间接识别病原物分泌的效应蛋白,从而激
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在自然环境中植物会受到各种各样的病原物威胁,为了抵抗病原物入侵,植物形成了极其复杂的防御系统,其中植物抗病基因(R基因)能够直接或间接识别病原物分泌的效应蛋白,从而激发下游抗病反应(effector triggerimmunity,ETI)。目前发现在植物中R蛋白结构大多为NBS-LRR(Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat)类型,由CC/TIR(coiled coil;Toll/interleukin-1 receptor like)、NB-ARC(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4)和LRR(Leucine Rich Repeat)三个结构域组成。NB-ARC片段高度保守,认为是"分子开关",可以通过一个催化和水解核苷酸的口袋结构结合ADP或ATP来调节植物抗病蛋白的构象变化,从而调节下游抗病信号传导途径。前人研究表明,在抗病反应中玉米花粉信号蛋白(PSiP)的NB-ARC结构域与核酸相互作用,调节信号传导途径,并且该反应不依赖核苷酸调节。解析该结构域晶体结构,将为深入阐释NB-ARC结构域结合核酸以调节后续反应的机制奠定了基础。本研究利用原核表达系统,将编码PSiP NB-ARC的DNA片段构建到含不同标签的原核表达载体中,热击转化到大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等不同表达菌株中,尝试不同诱导温度与IPTG诱导浓度等方法筛选最佳表达条件。通过亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等纯化方法对重组表达的NB-ARC结构域进行纯化,初步获得可溶性蛋白。正在利用TSA等方法筛选不同缓冲液体系,优化纯化流程,为最终获得均一性好,适合晶体生长的蛋白质样品,解析PSiP NB-ARC的三维空间结构和探究其与核酸相互作用功能提供结构基础。
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