【摘 要】
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为了揭示马立克病毒(Mareks disease virus,MDV)GX0101 ul24基因作用,分析u124目的蛋白的表达情况和细胞定位,本研究构建缺失GX0101 ul24基因的重组病毒,并且制备高效价鼠抗马立克病毒u124蛋白的多克隆抗体.试验以GX0101为载体,利用基于细菌人工染色体(BAC)的Red/ET和FLP/FRT同源重组的方法将卡那霉素抗性基因取代u124基因,构建GX01
【机 构】
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山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018
【出 处】
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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议
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为了揭示马立克病毒(Mareks disease virus,MDV)GX0101 ul24基因作用,分析u124目的蛋白的表达情况和细胞定位,本研究构建缺失GX0101 ul24基因的重组病毒,并且制备高效价鼠抗马立克病毒u124蛋白的多克隆抗体.试验以GX0101为载体,利用基于细菌人工染色体(BAC)的Red/ET和FLP/FRT同源重组的方法将卡那霉素抗性基因取代u124基因,构建GX0101 Δul24的重组病毒.然后以MDV GX0101为模板,利用PCR扩增ul24基因,分别克隆进原核表达载体pET-32a( + )和pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌感受态细胞Transetta( DE3 )中,经异丙基硫代-B-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化鉴定.用纯化的融合目的蛋白常规免疫5周龄Balb/c小鼠,制备抗ul24蛋白的多克隆抗体,用间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定多克隆抗体的特异性,用鼠源多抗血清进行免疫荧光检测,并运用激光共聚焦显微镜分析u124蛋白在鸡胚成纤维细胞(CEF)中的亚细胞定位.此外,本研究通过构建u124基因的真核表达重组质粒pEGFP-C1,将其转染于CEF细胞中,并在激光共聚焦显微镜直接观察u124蛋白在CEF细胞中的表达与定位.结果成功缺失u124基因并且将其BAC DNA经磷酸钙法转染CEF细胞中,拯救的重组病毒命名为GX0101 Δul24.经PCR验证后提取阳性菌质粒,ul24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后能获得与ul24蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体,激光共聚焦分析结果表明u124蛋白在细胞质中定位,真核表达重组质粒pEGFP-C1- ul24转染后36 h后荧光蛋白表达,定位在细胞质中.两种方法鉴定结果都表明ul24蛋白在细胞质中定位.制备的抗u124蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV ul24基因缺失株,为进一步研究ul24基因功能奠定基础.
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