家蚕BmDredd基因的克隆及其功能初探

来源 :中国蚕学会第八届青年学术研讨会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shylake
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  细胞凋亡是多细胞生物体正常的生理现象,对于生理和病理过程具有重要的意义.家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,属于完全变态昆虫,对家蚕变态期引发的细胞凋亡的研究具有重要的意义.本研究在家蚕中成功克隆了Caspase-8 的同源基因BmDredd,该基因位于家蚕第10 染色体上,全长1960bp,其中ORF 长1632bp(251-1882),编码543 个氨基酸,具有Caspase家族保守的特异的五肽结构域(QACRG),预测其蛋白分子量大小为63.4kDa,等电点为6.22.成功构建了BmDredd/pcoldII原核载体(制备抗体)、BmDredd/pIZ-DsRed 真核载体和BmDredd/pIZ-v5/His 干涉载体.结果表明当BmDredd 表达量达到一定浓度时,会发生自我剪切,活化为有一定功能的蛋白结构.在正常细胞中,BmDredd 蛋白是以酶原形式存在,而当Emodin诱导家蚕BmN-SWU1 细胞发生凋亡时,BmDredd 前体蛋白被活化行使凋亡功能,使得Caspase-8 酶活性升高.当凋亡信号刺激靶细胞时,可以激活细胞内源性的BmDredd 酶原,首先大小亚基组成异二聚体,然后两个二聚体形成同源四聚体(P20/P10)2,最后激活下游的Caspase 家族成员,引起细胞凋亡.此外,我们还发现BmDredd 可以诱导家蚕BmN-SWU1 细胞凋亡,具有Caspase-3/7,Caspase-8,Caspase-9 酶活性,且主要具有Caspase-8 酶活性;发现BmDredd 与死亡受体抗体TNFSF13 可以相互作用.细胞流式检测结果表明,BmDredd 基因过表达细胞凋亡率升高,而干涉BmDredd 基因后细胞凋亡率显著性降低,表明BmDredd 基因可以促进家蚕BmN-SWU1 细胞凋亡.通过实时定量结果显示,BmDredd 基因过表达后定量结果升高,干涉BmDredd 基因后其表达量显著性降低,BmDredd 基因过表达具有促进家蚕BmN-SWU1 细胞凋亡的作用.综上所述,BmDredd 基因确实参与死亡受体途径,行使Caspase-8 的同源基因的功能,能够促进家蚕BmN-SWU1 细胞的凋亡.
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