论文部分内容阅读
应用α芋螺毒素的保守信号肽序列及cDNA文库方法,我们从中国南海芋螺大理石、桶形、信号、堂皇、黑星芋螺等克隆了20余种新型α-芋螺多肽。通过合成、镇痛活性初筛,发现其中一些α-芋螺多肽具有显著的镇痛活性(中国发明专利号:ZL201010128797,ZL201110258344.9,201110258345.3,ZL201110086538.5),其中来自于黑星芋螺的α-芋螺多肽Eb1.6(序列为GCCSNPACMLKNPNLC-NH2,含两对二硫键(连接方式为1-3,2-4)镇痛活性最强,折叠效率高,毒性很低,因此我们对其结构、作用靶点、镇痛功能及成药性进行了系列研究。NMR结构研究显示Eb1.6分子的一侧呈正电荷分布,另一侧呈负电荷分布,靠近螺旋的K11附近有一个范围很大的正电荷区域。研究了Eb1.6对烟碱型乙酰胆碱各受体亚型、TTX-S及TTX-R钠离子通道、L-钙通道,DRG神经元钙通道、阿片受体、辣椒素受体、KCNQ1离子通道、HCN2通道等靶点的结合活性,结果表明Eb1.6对烟碱型乙酰胆碱各受体亚型α3β4、α7有一定活性外(10毫摩尔浓对α3β4、α7的抑制率为30～45%),其余较低,仍不能解释其很高的镇痛活性。系统研究了Eb1.6给予坐骨神经半切(PNL)手术大鼠后GABA、BDNF、GAP-413、NMDA、AMPA、TPH1、TRPV1、NGF-β、ATF3、PICK1、PKC-γ等与镇痛相关的单体mRNA表达量变化情况,结果表明Eb1.6能显著提高BDNF、NMDA、NGF-β、ATF3、GAP-43、PICK1的表达量,降低AMPA、GABA的表达量,而对PKC-γ、C-fos的表达量影响不显著。此外,Western Blot试验显示,Eb1.6能降低CaMKⅡ-β蛋白表达量,而对CaMKⅡ-α、CaMⅣ及c-Fox的表达量影响不显著。系统地应用大鼠坐骨神经半切模型(PNL)及松扎模型(CCI)模型、糖尿病周围神经疼痛模型、小鼠急性疼痛模型考察了Eb1.6的镇痛活性。大鼠的两个慢性疼痛模型显示,Eb1.6的镇痛活性(25微克/kg)显著高于最新的临床用慢性疼痛镇痛药吗啡与加巴喷丁(5 mg/kg+100mg/kg)的效果,活性相当于吗啡与加巴喷丁(5 mg/kg+100mg/kg)联合用药镇痛活性的1100倍多。小鼠热板模型及糖尿病慢性疼痛模型也显示Eb1.6有较好效果。系统开展了Eb1.6的规模合成、药物质量、急性毒性、刺激部位毒性、一般药理学、药代等研究。采用吸附树脂方法富集折叠的Eb1.6,大大降低了纯化成本。Eb1.6制剂单次及多次给药后对注射部位的刺激性很低,Eb1.6的急性毒性很低,无成瘾性,对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的毒性很低,显示其良好的发展前景。