【摘 要】
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谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的天然活性肽，在临床医药、食品工业及有关生物研究领域都有着广泛的应用前景.酿酒酵母体内合成谷胱甘肽的反应分为两步,其中第一步为限
【机 构】
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北京化工大学生命科学与技术学院,北京市生物加工过程重点实验室,北京,100029
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谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的天然活性肽，在临床医药、食品工业及有关生物研究领域都有着广泛的应用前景.酿酒酵母体内合成谷胱甘肽的反应分为两步,其中第一步为限速反应,该反应由GSH1基因编码的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成.本研究采取多拷贝该反应关键酶基因GSH1基因的策略,提高了酿酒酵母YS58中的谷胱甘肽产量,为谷胱甘肽工业重组菌的构建提供了基础.根据GenBank所公布的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GSH1基因序列,设计分别带有Hind Ⅲ、Xho Ⅰ酶切位点的上下游引物,通过PCR扩增出酿酒酵母菌X染色体上的GSH1基因.将该基因连接到pMD18-T载体上后测序,结果显示克隆片段与公布序列同源性为100％.将该片段进行双酶切后连接到GAL1启动子控制下的表达载体pYES2 ( Amp+,Ura+)上,构建了重组质粒pYES2-GSH1,用电转化方法将其转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YS58菌,尿嘧啶缺陷型选择培养基上筛选阳性克隆.重组菌进行50mL YPD摇瓶发酵,30℃、180rpm培养两天后分别转接于等体积的YPD培养基和半乳糖诱导培养基(1％酵母膏,2％蛋白胨,2％D-半乳糖),同等条件培养2天后,采用四氧嘧啶法进行谷胱甘肽产物测定.结果显示,经半乳糖诱导的重组菌谷胱甘肽产量(160.88～186.14mg/L)相比非诱导培养基中菌株产量(85.08～114.16 mg/L)提高40％以上.
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