背景 基因治疗是二十一世纪最具潜力的疾病治疗方式.载体的选择在基因治疗中具有非常重要的作用,目前主要分为病毒载体和非病毒载体两大类,由于病毒载体的随机整合特性以及本身的免疫原性而存在安全性的隐患,非病毒载体受到了广泛的关注.核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒载体系统一一核糖体基因区靶向载体(pHrneo),且证实该载体能携带多种治疗基因在多种细胞系中定点整合在人rDNA区并长期稳定地表达.进一步提高rDNA区的打靶效率将可能更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶原代细胞方面带来突破.近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上.目的 本研究拟探索建立联合锌指酶的靶向人rDNA区的高效打靶系统,为进一步发挥人核糖体打靶载体应用于基因治疗的潜能.方法 1、构建靶向rDNA区非编码的ITS区域的打靶载体pHr1-NL和pHr2-NL,同源臂分别为6.6kb和2kb.在同源臂间加入筛选基因一新霉素磷酸转移酶(Neo)基因,利用"启动子陷阱"策略富集同源重组子.并在筛选基因两侧加入同向的loxP位点；2、利用模块设计法设计构建锌指酶表达载体,通过体外快速设计鉴定法筛选获得有效的锌指酶；3、将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL联合有效的锌指酶核转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过加入G418筛选抗性克隆.两周后挑取克隆、PCR鉴定定点整合子,并统计定点整合效率.结果 1、酶切及测序鉴定,成功构建了载体pHr1-NL、pHr2-NL；2、体外快速鉴定法鉴定获得具有靶向切割能力的锌指酶ZFN-S3；3、PCR鉴定表明,pHr2-NL核转的HT1080细胞能在G418的筛选下获得定点整合克隆,联合锌指酶后打靶效率提高了约7倍.结论 建立了联合锌指酶的新的靶向人rDNA区的高效打靶系统,为核糖体DNA打靶载体进一步应用于基因治疗奠定了基础.