钩端螺旋体病(简称钩体病),是因感染具有致病性的钩体所引起的一种人兽共患病。犬钩端螺旋体病,是由常见对犬致病的犬型、黄疸出血型、塔拉索夫型等钩体所引起。犬对该病具有易感性,犬感染本病后,临床表现多样,不易进行诊断,因此需要实验室检测对本病进行辅助的鉴别诊断。常见实验室诊断方法有直接镜检,分离培养,血清学检测,动物接种等,但这些方法或不具备时效性,或缺乏准确性。相较于这些方法,聚合酶链反应(PCR)方法更省时省力,特异性和敏感性优异,并且可用于钩体病的早期诊断。本实验依据仅致病性钩端螺旋体含有的LigB基因序列的保守片段,并对常见对犬致病的钩体株的相关序列进行比对,设计了数对特异性的引物和探针,目的片段大小为124bp。对探针和引物进行筛选及反应条件与体系的优化,构建了含目的基因的质粒作为标准阳性对照,并对质粒进行测序验证。建立了犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断方法,并组装成可实现对犬钩体病进行快速高效诊断的试剂盒。对试剂盒的灵敏度、特异性、重复性等参数进行了检验,确定其保存条件和保存期,采集并检测临床犬血液和尿液样本,与显微凝集试验相比较,结果一致。钩端螺旋体的培养需要数周的时间,培养基的配制程序复杂,而诊断钩体病的金标准方法MAT,需要活体钩体才能进行诊断,因而很难得到推广和应用,而PCR方法不需要进行钩体的培养,并且相比于血清学方法,还可用于钩体病的早期诊断。在该实验中,建立的普通PCR方法检测钩体浓度的灵敏度可达到10~1,荧光定量PCR方法的灵敏度可达10~0。近年来,宠物犬的数量不断增加,各类工作犬的数量也有上升。犬易感钩体病,影响犬自身及其主人的健康,该检测方法可推广应用于犬钩体病的早期检测,避免该病的进一步发展和扩散。