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目的:揭示TNF-α和PGE2联合诱导人FLS异常增殖的分子机制,以深入阐明TNF-α和PGE2参与RA病程的分子病理机制.
方法:组织块培养法培养人FLS;MTT法检测TNF-α和PGE2联合介导的人FLS细胞的增殖情况;流式细胞术检测胞膜EP4受体表达;放免法检测细胞内cAMP浓度;Western blot法检测TNF-α和PGE2联合介导的TNF-α信号通路和G蛋白偶联信号中TRAF2、Gαs总蛋白、活性Gαs、EP4、GRK2的胞浆胞膜分布情况及对TRAF2与GRK2相互作用的影响.
结果:1.TNF-α和PGE2体外对人FLS增殖功能的影响：TNF-α和PGE2刺激人FLS增殖的亚适浓度分别为20ng/ml和0.35uM,作用最强在48h.TNF-α和PGE2刺激正常人FLS后可使细胞内cAMP水平显著降低,细胞增殖功能亢进.2.TNF-α和PGE2体外刺激对人FLS内G蛋白偶联信号中Gαs总蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4及胞膜和胞浆EP4蛋白表达的影响：由于EP4是通过偶联Gαs激活AC从而调节cAMP水平,因此检测TNF-α和PGE2处理后细胞中总Gαs蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4蛋白及胞膜和胞浆EP4蛋白的表达.结果显示,TNF-α和PGE2刺激显著增加了总EP4,胞浆EP4蛋白和EP4基因的表达;同时,显著降低了胞膜EP4蛋白的表达;进一步的结果发现,TNF-α和PGE2明显减少了活化Gαs蛋白的表达,而总Gαs蛋白表达无显著变化.TNF-α和PGE2通过TRAF2与GRK2偶联,调节胞膜GRK2蛋白的水平影响人FLS内G蛋白偶联信号：为了探讨TNF-α和PGE2如何通过其下游的分子降低cAMP水平,促进EP4受体的脱敏和内吞,进一步使用免疫共沉淀法检验TRAF2是否与GRK2或β-arrestin2蛋白偶联.结果发现TRAF2和GRK2或β-arrestin2均发生了相互作用,并且正常情况下人FLS中TRAF2-GRK2的相互作用较强,而当TNF-α和PGE2刺激后,相互作用的TRAF2和GRK2水平显著下降.进一步结果显示胞膜上的GRK2表达在一个较高的水平.TRAF2和β-arrestin2的偶联没有显著改变.
结论:TNF-α和PGE2可以显著促进人FLS的增殖,其机制不仅与TNF-α的受体偶联信号有关,且与其调节PGE2-EP4-Gαs-cAMP信号转导有关.正常FLS中,TRAF2和GRK2相互结合,TNF-α和PGE2刺激可上调TRAF2总表达,使其与GRK2分离,促进GRK2转膜,引起EP4受体脱敏和内吞,降低cAMP水平.