miR-497和miR-34a共同靶向cyclin E1抑制肺癌细胞生长

来源 :中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qq2009liuwei
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  [目的]探讨两个小分子RNA miR-497和miR-34a与细胞周期素cyclin E1在肺癌发生发展过程中的功能及其作用机制.[材料和方法]使用正常人支气管上皮细胞株16HBE和肺癌细胞株A549、H460、H1299、H446和QG-56进行培养与传代.提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,进行qRT-PCR实验,检测miR-497和miR-34a的表达.进行miRNA抑制剂和模拟物的瞬时转染后检测细胞miRNA表达情况、细胞周期分布、细胞增殖能力及软琼脂集落形成情况,并进行裸鼠成瘤实验.采用蛋白印迹法与双荧光素酶报告基因检测与验证miR-497或miR-34a与cyclin E1的编码基因CCNE1的结合位点.构建目的基因高表达载体,研究miR-497和miR-34a抑制肿瘤生长的协同效应.[结果]1.转染miR-497或miR-34amimic后,与对照组相比,肺癌细胞A549、H460和H1299细胞增殖被抑制,细胞活力降低,集落形成数减少.观察裸鼠体内成瘤情况发现,miR-497 mimic和miR-34a mimic组肿瘤平均重量和体积均明显低于对照组.说明miR-497和miR-34a具有抑癌作用.2.利用RNAhybrid等生物信息软件预测到miR-497和miR-34a共同靶点为CCNE1.A549、H460和H1299细胞转染miR-497或miR-34a模拟物后CCNE1蛋白水平均降低.与共转染荧光素酶报告基因载体和模拟物对照相比,荧光素酶报告基因载体和miR-497或miR-34a模拟物的共转染后荧光素酶活性均明显降低(P<0.01).3.与对照组相比,CCNE1 siRNA组的cyclin E1蛋白的表达明显降低,A549细胞增殖出现抑制,而共转染CCNE1 siRNA和miR-497或miR-34a mimic后细胞增殖不受影响,细胞周期分布基本不受影响,说明CCNE1是miR-497和miR-34a的一个功能性的靶点.4.构建高表达载体,Hi-miR497/34a组与单独转染Hi-miR497或Hi-miR-34a组相比,细胞活性明显减低,集落形成明显减少,裸鼠体内形成肿瘤的体积与重量显著减少.miR-497和miR-34a在抑制肿瘤生长时两者具有协同作用,并在共同靶向于CCNE1时,两者仍表现为协同效应.[结论]miR-497和miR-34a作为抑癌基因,能够抑制肺癌细胞的生长、体外细胞克隆的形成和体内细胞肿瘤的形成,这种抑制作用是通过负调控癌基因cyclin E1来发挥作用,这为今后miRNA应用于临床治疗肺癌提供了新的证据和方法.
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