论文部分内容阅读
[目的]鸡坏死性肠炎由A型产气荚膜梭菌引起,随着其耐药性的增加,养禽业中控制与预防该病的成本在逐渐增加,因此了解该菌的耐药性和毒力情况可对临床用药提供科学依据与指导。本研究以分离自健康鸡和病鸡的74株A型产气荚膜梭菌为研究对象,测定不同药物对其最小抑菌浓度,同时检测耐药基因与毒素基因,探索是否有菌株产生耐药的同时又携带较为重要的毒素基因。[方法]本试验使用磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、青霉素、氨苄西林、泰乐菌素、红霉素、金霉素、土霉素、多西环素、杆菌肽、杆菌肽锌、林可霉素、克林霉素、庆大霉素、甲硝唑、恩诺沙星共16种药物测定对菌株的最小抑菌浓度,药敏试验方法依据CLSI （2018）文件推荐使用的琼脂稀释法进行。将药物采用合适的溶剂溶解配制成5120μg/mL储存液于-20℃保存,试验时使用灭菌肉汤或生理盐水倍比稀释,添加至绵羊血琼脂混匀制成终浓度在0.03-512μg/mL之间的含药平板。利用多点接种仪将稀释至0.5麦氏比浊度的菌液接种于含药平板,厌氧环境下培养18-24h后判定结果,根据CLSI （2018）文件给出的耐药折点值和MIC90判断是否耐药。利用PCR检测菌株是否携带毒素基因cpb2、cpe与netB,耐药基因lnu（A）、lnu（B）、tet（M）、tet（L）、tet（K）、tetB（P）、tetP（B）、mef（A）、ermB和ermQ,扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段经测序比对分析确定。[结果]在测得的药敏试验结果中,青霉素、氨苄西林最为敏感,磺胺类药物耐药率最高,其余药物呈现不同的耐药率,这可能与养殖场药物使用情况有关。杆菌肽、杆菌肽锌耐药率分别为12.16%、6.76%,这两种药物常作为饲料添加剂来预防坏死性肠炎等疾病,但根据MIC90判断测试菌株中对两者耐药的并不多,我们推测可能在菌株来源的养殖场中两种药物的使用量少,还可能与菌株数量比较少有关,其余无耐药折点值的药物均是如此。另外对菌株的耐药谱统计分析发现,耐3种药物或3种以上药物的菌株达66株,占比达89%,其中有1株同时对12种被检药物耐药。毒素基因的扩增结果表明,在所有菌株中未扩增到cpe毒素基因,cpb2、netB毒素基因检出率分别为71.6%（53株）与9.5%（7株）。在检出neB毒素基因的菌株中,其中6株同时检出cpb2毒素基因。有文献报道两种毒素都可位于质粒,但本研究中同时包含两种毒素基因的菌株所携带的毒素基因是否位于质粒还有待进一步验证。在携带netB毒素基因的菌株中,有1株对6种药物耐药,这提示我们如果在未了解菌株耐药背景的情况下盲目、错误地使用药物治疗,将有很大可能错过最佳治疗时期,造成更多的损失。此外,我们测定了44株菌株（42株多耐菌株与2株仅对磺胺类药物耐药菌株）中已有文献报道的部分耐药基因,其中检出含四环素类耐药基因tetA（P）29株、tetB（P）23株、tetP（B）9株、tet（K）1株,含大环内酯类耐药基因ermQ 20株、ermB 1株,林可酰胺类耐药基因lnu（A）1株、lnu（B）2株。另外我们还发现,在一些不存在耐药表型的菌株中也扩增到了耐药基因,如在对四环素类药物敏感的菌株中扩增到了tetA （P）和tetB（P）基因,推测可能是由于该基因表达量低不足以引起耐药表型;也有存在耐药表型但未扩增到相应耐药基因的菌株,如林可酰胺类,推测可能是由于其它耐药基因或基因突变所造成的。[结论]临床分离的产气荚膜梭菌耐药情况较为严重,部分菌株虽无耐药表型但存在耐药基因,在一定程度上会增加耐药性的传播风险。毒素基因检测结果表明含有多种毒素基因的菌株中存在着多重耐药性,增加了临床治疗失败的风险,因此养殖环节中对疾病的防治应在了解致病菌耐药背景后有针对性地选择药物使用。