【摘 要】
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目的：验证新型羟基磷灰石/壳聚糖/丝素蛋白多层多孔支架的生物相容性,并探究灌流和周期性压应力对种植其上的骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化的作用及机制.方法：检测支架的力学特性并得出压缩应力/压缩位移曲线.检测其孔隙率.HE染色及μCT观察支架内部结构.CCK8检测支架浸提液培养下的细胞增殖.HE染色和活死细胞染色观察细胞支架共培养.扫描电镜观察支架上细胞的生长.SD大鼠背部皮下包埋支架观察支架组织
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科
【出 处】
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中华医学会第十八届骨科学术会议暨第十一届COA国际学术大会
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目的：验证新型羟基磷灰石/壳聚糖/丝素蛋白多层多孔支架的生物相容性,并探究灌流和周期性压应力对种植其上的骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化的作用及机制.方法：检测支架的力学特性并得出压缩应力/压缩位移曲线.检测其孔隙率.HE染色及μCT观察支架内部结构.CCK8检测支架浸提液培养下的细胞增殖.HE染色和活死细胞染色观察细胞支架共培养.扫描电镜观察支架上细胞的生长.SD大鼠背部皮下包埋支架观察支架组织相容性和降解吸收.免疫组化检测大鼠骨髓间充质干细胞在支架上的成软骨分化.力学检测静态、灌流(10ml/min)、灌流(10ml/min)+周期性压应力(2h/次,4次/天,压缩形变10％,即压缩位移0.4mm)三种条件干预4周,细胞支架复合体的压应力/压应变曲线.PCR及western blotting检测三种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞的成软骨分化指标(Aggrecan/Collagen Ⅱ/SOX9),并收集上清Elisa检测bFGF/IGF-1/TGFβ-1.家猪骨髓干细胞支架复合体植入家猪股骨髁人造软骨缺损中,术后1,2,3个月磁共振平扫及增强和最终大体标本HE染色观察软骨缺损修复情况.10mM浓度LY364947抑制TGFβ-1通路相关蛋白.结果：羟基磷灰石/壳聚糖/丝素蛋白支架内部高度互联多孔,具备良好机械特性.压缩形变达到75％(压缩位移3mm/支架厚度4mm)时,可承受压应力76.32±7.39N.平均孔隙率达83.5％.HE染色及μCT可见支架内部多孔且高度互联.CCK8未发现支架浸出毒性,浸提组与对照组的细胞增殖OD值在1,3,5,7天均未见统计学差异.HE染色及活死细胞染色显示支架上大量细胞附着生长,细胞随时间延长向支架内部迁移.扫描电镜可见大量细胞附着于支架表面.支架植入大鼠皮下后2周,可见大量炎症细胞集聚支架周围.8周后,支架显著分解吸收.免疫组化结果显示SD大鼠骨髓间充质干细胞可在支架上诱导成软骨.力学检测提示,灌流+周期性压应力组及单纯灌流组的支架,压缩形变达到75％时可承受压力均较静态培养组显著提高.PCR、Western和Elisa的结果表明灌流+周期性压应力组及单纯灌流组的成软骨分化效应均较静态培养组显著提高.随时间延长,干细胞支架复合体逐步修复家猪股骨髁软骨缺损.周期性压应力及灌流通过TGFβ-1/smad通路调节干细胞的成软骨分化效应.结论：羟基磷灰石/壳聚糖/丝素蛋白构筑的多层多孔支架具备良好的力学特性和干细胞相容性及可降解性.周期性压应力结合灌流刺激可促进干细胞软骨方向的分化.这种刺激很可能通过TGFβ-1/smad通路来起作用.
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