【摘 要】
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目的近年来发现肝配蛋白ephrin及其受体Eph参与了调控骨骼发育、骨骼重塑、干细胞成骨分化.ephrin和Ehp家族共有21个分子,目前已有研究证实了ephrinB2和EphB4、ephrinB1调控成骨细胞的成骨分化,但还没有确切的研究说明其他分子对骨骼的发育、重塑或MSC成骨分化是否有影响.本研究在体外三维培养环境下深入研究了EphB6对小鼠MSC成骨分化的抑制作用及机制.方法以组织工程
【机 构】
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第三军医大学西南医院骨科;第181医院 第三军医大学西南医院骨科
【出 处】
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中华医学会第十七届骨科学术会议暨第十届COA国际学术大会
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目的近年来发现肝配蛋白ephrin及其受体Eph参与了调控骨骼发育、骨骼重塑、干细胞成骨分化.ephrin和Ehp家族共有21个分子,目前已有研究证实了ephrinB2和EphB4、ephrinB1调控成骨细胞的成骨分化,但还没有确切的研究说明其他分子对骨骼的发育、重塑或MSC成骨分化是否有影响.本研究在体外三维培养环境下深入研究了EphB6对小鼠MSC成骨分化的抑制作用及机制.方法以组织工程骨中三维培养的小鼠MSC为研究对象,检测MSC成骨分化后的ephrin、Eph家族基因表达变化,确定EphB6为主要研究对象后,通过配体激活、siRNA、过表达等方法研究其对MSC成骨分化的影响.为了解EphB6的下游信号,检测MSC成骨分化前后的RhoA磷酸化水平,并用ROCK抑制剂阻断RhoA-ROCK通路后检测MSC成骨分化.结果定量PCR和免疫荧光染色表明EphB6在MSC成骨分化时表达下调.EphB6与配体ephrinB1-Fc结合后使ALP活性和Runx2表达降低.siRNA沉默EphB6使MSC的Runx2表达上调,ALP活性增高,钙结节染色增强,而过表达EphB6则出现相反的结果.但上述siRNA和过表达均不会影响MSC的成软骨分化和成脂肪分化.RhoA的磷酸化水平与成骨分化呈负相关,受到EphB6siRNA干扰的细胞在成骨诱导培养第7天有更多GTPRhoA,而过表达的细胞则显著减少.在MSC成骨诱导培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632,发现Runx2的表达上调,在siRNA干扰和过表达EphB6的细胞中也同样检测到Runx2的表达上调.结论本研究以组织工程骨为基础,研究了体外三维培养环境中MSC成骨分化的调控因素,发现EphB6在MSC成骨分化时表达下调,与配体ephrinB1结合后会抑制成骨分化;siRNA减少EphB6表达能促进MSC成骨分化,而过表达EphB6则抑制MSC成骨分化.可见EphB6具有抑制MSC成骨分化的作用.进一步的机制研究发现EphB6可能是通过提高RhoA磷酸化水平来抑制MSC成骨分化的.siRNA干扰和过表达均不会影响MSC的成软骨分化和成脂肪分化.提示EphB6是在MSC成骨分化的过程中发挥作用,而不会影响MSC的分化启动阶段,即是并未弱化MSC的多向分化潜能.
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