目的:(1)肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因,非小细胞肺癌NSCLC约占肺癌病例的85%,肺癌5年生存率约为15%。肺癌具有多种分子生物学改变以及异质性明显的特点,目前肺癌精确治疗的现状策略包括早期检测筛查和预防,靶向肺癌干细胞和微环境的治疗,靶向驱动基因的策略。尤其是肿瘤精准治疗依托肿瘤基因与蛋白等综合全面的分子检测,结合高通量测序(Next-Generation Sequencing,NGS)大数据的深入分析,指导临床治疗方案的个体化选择,寻找靶基因/适应症,探索耐药机制,多靶点临床试验病人筛查和随访,进一步夯实晚期肺癌精准治疗的策略与实践水平。(2)依据中晚期肺癌侵袭转移的中医基本病机变化,结合前期研究结果,组成益气养肺方(SENL),共奏补益脾肺之气、滋养肺胃之阴,兼清热解毒、活血化瘀之功效。SENL明显改善肺癌临床症状,降低化疗毒副反应,提高生存质量。由于多药耐药是肺癌治疗乏效主要原因,与肿瘤微环境密切相关,我们前期研究发现益气养肺方SENL拮抗肺癌化疗耐药,下调线粒体膜电位水平,上调半胱天冬酶活性。近期研究显示碱性成纤维生长因子(bFGF)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达增强,作为肺癌原发性耐药重要标志物,益气养肺方SENL明显抑制肺癌bFGF表达。研究SENL联合化疗增效减毒,干预肿瘤微环境拮抗肺癌耐药,同时SENL及bFGF单抗调控肺癌bFGF/FGFR1通路,抑制肺癌侵袭转移中发挥重要作用。(3)从精准医学角度深入研究中医中药复方提升肺癌疗效的关键干预靶点,充实益气养肺方拮抗肺癌侵袭转移的科学内涵,探索中西医最佳联合治疗策略和实践结合新模式,提供可靠的科学研究依据。方法:(1)从生物学上进一步研究肺腺癌的多药耐药的机制有助于发现新的靶向分子,从而提高肺癌的治疗效果。我们采用Illumina HiSeq2000测序系统对肺腺癌细胞和肺腺癌耐药细胞进行了高深度的转录组测序。使用BWA软件对两个转录组文库进行比对分析。运用RSEM分析方法和BGI提供的基于泊松分布的分析方法对基因的表达,分析mRNA转录组测序能够挖掘肺腺癌多药耐药的潜在驱动基因。(2)SENL联合化疗与单纯化疗比较治疗NSCLC的随机对照试验(RCT),按照Jadad评分量表对纳入文献进行质量评价,采用RevMan5.0软件进行Meta分析。HPLC同时测定SENL活性成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg3、黄芪甲苷、麦冬皂苷D、粉防己碱的含量。SENL联合化疗对A549/DDP裸鼠体内移植瘤的影响,SENL逆转A549/DDP裸鼠移植瘤化疗耐药的机制研究:采用免疫组织化学法测定各组A549/DDP肿瘤组织多药耐药相关蛋白(MRP-1)、GST-π蛋白的表达;间质细胞标志物纤维连接蛋白(Fibronectin)表达;细胞因子调节因子bFGF蛋白表达;CD31染色标记肿瘤微血管密度MVD;TUNEL法检测瘤内细胞凋亡率。qPCR法测定各组肿瘤组织mdr1 mRNA、mrp1 mRNA、bfgf mRNA、fgfr mRNA表达。Western blotting法检测各组肿瘤组织磷酸化AKT、总AKT、磷酸化mTOR、总mTOR、bFGF、FGFR蛋白表达。(3)针对bFGF在实体瘤发生发展的重要作用,研究开展针对bFGF靶向研究-新型抗bFGF中和性抗体阻抑FGFR1活性作用,研究bFGF单抗抑制肿瘤、抗血管生成、抗转移、逆转多药耐药(MDR)作用。通过bFGF单克隆抗体制备,采用CCK-8法检测bFGF单抗对肿瘤细胞增殖抑制实验,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期改变,实时荧光定量PCR和western blot检测MDR1、bFGF和FGFR等相关基因表达,bFGF单抗调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,bFGF单抗体内药代动力学研究等体内外研究。结果:(1)在敏感和耐药转录组文库,分别得到54532764和51838982个双端90bp的clean reads,采用BWA比对分析软件,分别有65.08%和76.31%的reads定位到了人类参考基因组hg19,通过RSEM的分析方法分别检测到17300和16422个表达基因。根据BGI提供的基于泊松分布的分析方法,检测到6002个差异表达基因,在耐药细胞中,有3367个基因表达上调,2635个基因表达下调(FDR≤0.001且|log2(Foldchange)|≥1)。为了进一步了解多药耐药的机制,我们收集了20个与多药耐药相关的驱动基因。这些基因参与多种信号通路,例如血管生成,发病机理,细胞死亡,细胞生长,细胞分裂,细胞周期,细胞增殖,细胞凋亡进程,细胞的分化和药物代谢。结果显示90%(18/20)的基因(GSTP1,MET,ROS1,PRKCA,ABCG2,MMP1,ABCB1,VEGFA,KRAS,LRP1,ABCC1,PIK3CA,COX5A,BRAF,EGFR,PTEN,ALK,FGFR1)在耐药细胞A中表达有增加,其中35%(7/20)的基因(GSTP1,MET,ROS1,PRKCA,ABCG2,MMP1,ABCB1)在A549/DDP中表达显著上调(FDR≤0.001且|log2(Foldchange)|≥1),ROS1的上调倍数甚至达到了227倍。(2)SENL联合化疗能提高非小细胞肺癌的客观缓解率(RR=1.37,95%CI(1.16,1.61),P=0.0001),提高患者的1年生存率(P=0.006),能提高患者的生存质量,改善中医证候,降低白细胞减少、血小板减少、血红蛋白减少等骨髓抑制的风险。初步测定SENL6种化学成分的含量:每剂SENL含有人参皂苷Rg1 51.0±2.1mg、人参皂苷Rb1 49.5±2.5mg,人参皂苷Rg3 7.95±0.71mg,黄芪甲苷0.77±0.03mg,粉防己碱103.5±3.1mg、麦冬皂苷D1.29±0.02mg。研究结果表明SENL均对A549/DDP实体瘤生长具有显著的抑制作用,抑制率分别为66.8%,SENL能明显降低A549/DDP肿瘤组织MRP1蛋白、mdr1和mrp1 mRNA表达降低GST-π蛋白表达;可诱导多药耐药肺癌细胞凋亡,抑制肿瘤新生血管生成,抑制bFGF/FGFR通路,抑制PI3K/AKT/mTOR通路。(3)bFGF单抗有效抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤侵袭和转移和逆转多药耐药,上调caspase-3、caspase-9,PARP的表达,bFGF单抗抑制肿瘤细胞Akt、mTOR磷酸化水平,bFGF单抗明显抑制裸鼠体内移植瘤生长。bFGF单抗增强放射治疗敏感性,放射增敏率为2.37,抑制bFGF、VEGF表达,抑制肿瘤血管新生;bFGF单抗下调MDR1/P-gp的表达、抑制P-gp功能以及增加细胞内化疗药物浓度,达到逆转肿瘤化疗耐药作用。bFGF单抗T1/2α为0.2 h,T1/2β为1.84h,T1/2γ为90.3 h,bFGF单抗药代动力学符合三室模型,且组织分布特异性高。体内外研究表明bFGF单抗具有显著抗肿瘤和抗血管生成作用,值得更深入阐明其分子靶向治疗有效性和安全性。(4)多药耐药基因表达和肿瘤微环境转导通路激活,将耐药肺癌细胞与肿瘤微环境作为统一整体,阐明益气养肺中药拮抗肺癌耐药发病机理,拓宽中医药防治耐药研究思路,为针对性筛选逆转肺癌耐药的有效中药及复方提供研究依据,为进一步解决肺癌化疗耐药和转移难题作出有效探索。结论:(1)精准抗癌与临床肿瘤学的创新性结合,进一步助推肿瘤精确诊断与分子靶向治疗优势。SENL与bFGF单抗的进一步深入研究有助于确认其联合化疗和放疗的疗效。提高精准抗癌研究水平的关键技术,推进和加速精准抗癌的新型技术临床前研究。分子靶向药物在临床肿瘤精准治疗中的应用潜力巨大,前景光明,将进一步夯实精准抗癌的临床实效和前沿水平。开展精准医学应用于肺癌全病程管理,包括肺癌早期筛查、分子分型诊断,靶向治疗,预后分析和复发治疗,尤其针对常见的耐药位点和药靶点检测,为肺癌患者提供精准治疗方案。依托强有力的肿瘤诊疗团队,实现更全的肿瘤预防,更多的早期干预,更高的精准治疗,更好的临床疗效。(2)重要研究成果:(1)肿瘤个体化精准诊治成功救治恶性肿瘤合并急危重及复杂疑难病例,分子靶向综合治疗提高患者生存质量。(3)主要研究包括肿瘤耐药与转移的分子靶点及其精准治疗,抑制肿瘤及其血管新生靶点新型人源抗体药物临床前研究,肿瘤转移和分子靶向治疗耐药差异性表达,关联调控分子靶点预测及其精准干预研究。(4)承担国家及省部级科研基金10项,包括国家自然科学基金3项,国家科技重大专项和广东省重大新药创制重大科技专项3项等,以第一和通讯作者发表SCI科研论文28篇,出版学术专著3部。在2014年国际抗癌联盟(UICC)主办世界抗癌大会,2015年第16届世界肺癌大会及2016年第42届韩国亚太临床肿瘤学大会分别作大会报告。(5)荣获国家中西医结合优秀青年贡献奖(2011年),第三届梁仲景临床医学科研奖一等奖(2016年),韩国临床肿瘤学会研究奖(2015年),广东省首批医疗技术优秀技术负责人奖(2014年),中华中医药学会科学技术奖二等奖(2008年),内蒙古自治区科学技术三等奖(2005年),解放军队科技进步三等奖(2000年)。