【摘 要】
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该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因细胞或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因
【机 构】
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佛山大学医学院,广东佛山 528000
【出 处】
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中华医学会2012年医学遗传学年会暨全国第十一次医学遗传学学术会议
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该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因细胞或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokI的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8％；而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2％,较常规基因打靶定点整合率(10-6-10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.该研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为人类基因治疗和动物定点转基因提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.
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