【摘 要】
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HIV-1蛋白酶(PR)活性的严格调控对于病毒的生存至关重要。在病毒蛋白表达及病毒颗粒装配过程中，处于病毒前体蛋白Gag-Pol中的蛋白酶必须以无活性状态存在，避免前体蛋白Gag-Pol和Gag被提前酶切加工(前体蛋白早成熟化)。干扰HIV-1蛋白酶活性的调控机制，特异性地激活前体蛋白中的蛋白酶，诱导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制。本课题根据这一设想，运用生物发光共振能量转移(BRET
【机 构】
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中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室 北京 100050
【出 处】
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第十一届全国抗生素(微生物药物)学术会议
论文部分内容阅读
HIV-1蛋白酶(PR)活性的严格调控对于病毒的生存至关重要。在病毒蛋白表达及病毒颗粒装配过程中，处于病毒前体蛋白Gag-Pol中的蛋白酶必须以无活性状态存在，避免前体蛋白Gag-Pol和Gag被提前酶切加工(前体蛋白早成熟化)。干扰HIV-1蛋白酶活性的调控机制，特异性地激活前体蛋白中的蛋白酶，诱导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制。本课题根据这一设想，运用生物发光共振能量转移(BRET)技术，建立了细胞水平的HIV-1前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型。本工作中，我们构建和表达融合蛋白EYFP-p2／p7-Rluc。该融合蛋白为在增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和海肾荧光素酶(Rluc)之间插入HIV-1蛋白酶剪切位点(p2／p7序列)。该模型的工作原理为，当加入Rluc底物，将产生发射光(λem～475 nm),Rluc催化产生的光波发生能量转移，激发同处于融合蛋白中的受体EYFP,产生激发光(λem～535 nm)。当HIV-1蛋白酶剪切EYFP和Rluc之间的p2／p7序列，使得EYFP和Rluc成为两个独立的蛋白。两者从融合状态改变成分离状态将直接阻断了能量转移，导致BRET比值下降。随后，我们用pEYFP-p2／p7-Rluc和不同的Gag-Pol表达质粒共转染293T细胞，然后进行了Western Blot分析和BRET比值测定。结果证实了Gag-Pol中的蛋白酶活化之后，可以酶切p2／p7序列，并相应地引起BRET比值的下降。当在p2／p7序列进行了点突变，使得HIV-1蛋白酶不能酶切该序列，则BRET比值基本不变，验证上述实验现象是HIV-1蛋白酶特异性酶切的结果。前期工作表明efavirenz(EFV)和etravirine(TMC-125)，能加速Gag-Pol的二聚化，导致细胞内被激活的HIV-1蛋白酶增多。与该结果相吻合,EFV和TMC-125处理可以明显下调BRET比值，而蛋白酶抑制剂Saquinavir则显著提高了BRET比值。随后，我们选取EFV作为模型的阳性对照药物，对筛选模型进行了评价。研究结果表明该筛选方法灵敏可靠，特异性高，重复性好(Z因子为0.905)，达到高通量筛选模型的统计学要求。最后应用该模型对我所的化合物库进行了初步的筛选(2000个化合物)，其中初筛阳性化合物3个，阳性率为0.15％。目前，艾滋病的防治主要是依靠药物治疗。临床上使用的抗HIV-1的药物均针对新产生的病毒，阻止新病毒感染新的细胞，但无法清除感染的细胞。本研究选择HIV-1前体蛋白早成熟化作为抗HIV-1药物靶点，以期获得可以激活前体蛋白早成熟化的新型抗HIV-1药物。这一新型抗病毒药物可以提前激活Gag-Pol中的蛋白酶，直接抑制病毒的装配。同时，由于蛋白酶具有细胞毒性，能引起细胞凋亡，所以有可能清除被病毒感染的细胞，从源头上抑制病毒的生长，将成为根除艾滋病的化学药物治疗的发展方向之一。
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