目的：建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫的i重荧光定量PCR方法。方法：根据基因库中单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫基因序列。设计了三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反廊条件和试剂浓度进行优化，建立了能够同时检测单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。结果：该方法对单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫的检测敏感性分别达到40、400和40个模板拷贝数；此外抗十扰能力强，对单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合，仍可有效地同时枪测这三个原虫，对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶m弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测，结果全为阴性。结论：研究建立的单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫多重荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点，可用于临床上单孢子虫、派琴虫病和折光马尔太虫感染的检测。