【摘 要】
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[目的]目的构建p21基因慢病毒shRNA载体并进行鉴定,为进一步探讨p21基因在喹乙醇诱导细胞凋亡及其S期阻滞的机理研究提供实验材料.[方法]方法1.构建3条p21基因慢病毒shRNA载体：将目的基因干扰序列连接到pLKO.1干扰慢病毒载体后将其转进细菌感受态细胞中,等生成克隆菌落后进行PCR测序鉴定,测序比对正确的克隆即为所需的p21基因RNAi慢病毒载体.2.包装慢病毒及测定病毒滴度：抽提高
【机 构】
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中国农业大学动物医学院,北京100193
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨
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[目的]目的构建p21基因慢病毒shRNA载体并进行鉴定,为进一步探讨p21基因在喹乙醇诱导细胞凋亡及其S期阻滞的机理研究提供实验材料.[方法]方法1.构建3条p21基因慢病毒shRNA载体：将目的基因干扰序列连接到pLKO.1干扰慢病毒载体后将其转进细菌感受态细胞中,等生成克隆菌落后进行PCR测序鉴定,测序比对正确的克隆即为所需的p21基因RNAi慢病毒载体.2.包装慢病毒及测定病毒滴度：抽提高纯度、无内毒素的慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒,使用HP transgenereagent将两者共转染到293T细胞,通过促转染、换液、培养等处理后,获取细胞上清液,进一步经浓缩后获得高滴度慢病毒浓缩液,在293T细胞中标定其病毒滴度.3.干扰载体对HepG2细胞内p21的沉默评价：用包装好的慢病毒以及慢病毒阴性对照感染靶细胞HepG2,感染成功后通过Western Blot和RT-PCR方法评价干扰载体对靶基因的干扰效果.[结果]1.对构建好的3条慢病毒干扰载体经PCR测序鉴定,DNA序列均无位点突变,证明质粒构建成功.2.将构建好的慢病毒载体质粒阳性克隆菌株转染293T细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光；在293T细胞中进行病毒包装,最终纯化出pLKO.1-p21慢病毒颗粒,并测得其滴度为1*109TU/ml. 3.病毒感染HepG2细胞后,经Western blot及RT-PCR验证,3条shRNA均有一定的沉默,其中以p21-shRNA3最明显.[结论]1.通过RNA干扰技术,成功构建了p21基因慢病毒shRNA载体.2.构建的干扰载体能够顺利的进行慢病毒的包装,并获得较高的病毒滴度.3.RT-PCR及Western blot检测结果表明,p21-shRNA3为p21三个靶点中沉默效果最佳者,由其感染的HepG2细胞株为探讨p21基因在喹乙醇诱导细胞凋亡及其S期阻滞的机理研究提供实验材料JNK/GADD45a信号通路的激活参与喹乙醇诱导的DNA损伤及S期阻滞.
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