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施肥是作物高产的重要保障.长期施肥可能造成土壤理化性质的改变,并影响特定功能微生物的组成及活性,但由于技术手段的限制,目前对施肥的微生物效应还缺乏整体了解.新一代高通量测序技术的发展为土壤微生物群落解析提供了前所未有的广度和深度,本研究即基于454高通量测序方法,对长期施肥农田土壤中的原核生物群落进行深度分析,以了解不同施肥措施下土壤微生物群落的响应情况.本研究选取其中的对照(不施肥,记为CK)、施化肥(混施尿素、过磷酸钙和氯化钾,记为NPK)和化肥、有机肥混施(混施化肥和秸秆还田,记为NPK/OM)三个处理,每个处理采集3个重复土样,提取土壤DNA,以带有Barcode的通用引物扩增16S rRNA基因片段,对扩增产物进行454高通量测序,共获得了92 140个高质量的序列.分析显示,92 140个序列分属20个细菌门(phylum)和2个古菌门.在所有处理中,相对丰度前4位的细菌依次为Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria 和Actinobacteria,占到总体原核生物的64.0％ ～ 65.8％.随着施肥强度的增加,Proteobacteria、Bacteroidetes、Nitrospira、Chloroflexi、Verrucomicrobia、 Spirochaetes等的丰度增加,而Acidobacteria、 Actinobacteria、Chloroflexi等的比例减少；混施化肥和秸秆还田(NPK/OM)显著增加Bacteroidetes的比例,而Crenarchaeota的丰度随化肥的施用显著提高(ANOVA,P＜0.05).此外,某些功能微生物随施肥发生了明显的改变.在属(Genus)水平,秸秆还田对专性厌氧发酵细菌Opitutus的促进作用明显,与硝化作用相关的Nitrosospira和与磷代谢相关的Gemmatimonas随着化肥的施用其相对丰度显著增加,提示这些微生物在土壤碳、氮、磷循环中的潜在作用.此外,Acidobacteria中的Gp1、Actinobacteria中的Arthrobacter、δ-proteobacteria中的Desulfobacca、γ-proteobacteria中的Luteimonas等也受到施肥的显著影响,表明它们可能在稻田土壤的养分循环中起一定作用.这些结果说明长期施肥对于土壤原核群落具有明显的选择作用.微生物对施肥的不同响应可能反映了其生态功能,其相对丰度的变化为了解它们的作用提供了线索.同时,本研究展示了高通量测序技术在揭示土壤微生物群落整体组成方面的独特优势,具有广阔的应用前景.