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大豆是社会生活所需的主要农作物之一,富含优质食用油脂、优质植物蛋白和多种对人体有益的生理活性物质,是世界上重要的油料作物、粮食作物、饲料作物、蔬菜作物和经济作物。大豆疫霉根腐病（Phytophthora sojae M.J.Kauf-mann&J.W.Gerdemann,）是一种由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufinann&Gerdemann）引起的分布较广、为害极其严重的世界性病害,是大豆生产上的毁灭性病害之一,也是大田作物中唯一为害严重的疫霉病害。迄今,在世界大豆主产区仍呈扩大蔓延之势,对大豆生产构成巨大的潜在威胁。迄今为止,防治该病最为有效的手段就是选用抗病品种。大豆疫霉菌毒力结构趋于复杂化、生理小种进化速度快;而常规的育种工作周期长,工作效率低,抗性资源有限,很难满足生产的需要。现代生物工程技术可以打破生物之间的界限,实现遗传物质的重新组合,为大豆的育种工作开辟了一条全新的途径,因此,利用抗病基因工程育种是解决该难题的有希望的途径之一。激发子是一类能够诱导寄主或非寄主植物产生防卫反应的特殊化合物。Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸、对热稳定对蛋白酶K敏感的一类蛋白,它的一个重要功能是激发HR反应,而HR反应被认为是植物防卫反应的一种表现。hrp基因在植物病原细菌定殖和植物防卫反应诱导等方面具有重要作用。在烟草野火病原菌中发现的hrpZpsta基因是hrp基因家族中的一,hrpZpsta基因编码的harpin蛋白能诱导植物产生一系列抗性反应,使植物获得广谱的抗病、抗虫能力,并且能够促进植物生长。转基因抗病植物由于外源基因的转入可以大幅度的提高作物抗病的能力,随着hrp基因作用机制的深入研究以及分子遗传操作技术的逐渐成熟,利用基因工程技术构建环保、方便、有效的大豆疫霉根腐病防治策略逐渐成为研究热点。我国作为世界第四位大豆主产的国家,转基因大豆技术研究却尚在起步阶段,本研究以大豆研究中常用的模式品种（Jack,Williams 82）及大豆生产品种沈农9号、华春6号等作为转基因受体,以hrpZpsta基因为目的基因,构建含草甘膦作为筛选标记的表达载体,采用根癌农杆菌介导法,将目标基因转入受体品种中,以期获得转hrpZpsta基因对大豆疫霉根腐病具有较高抗性的转基因大豆新种质并明确对大豆疫霉根腐病的抗性功能。为大豆的抗病育种以及研究hrpZpsta基因功能奠定基础。本研究在创制新种质的同时,跟踪了国际转基因技术研究前沿,为提升我国大豆生物育种水平储备了技术。本研究主要结果如下:（1）本研究根据大豆密码子偏爱性,把来源于烟草野火病病原菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）Psta218菌株的hrpZpsta基因进行人工优化合成（该基因大小为423 bp,编码141个氨基酸,表达的蛋白大小为15kD）构建到植物表达载体pTF101-Gmubi3中,构建植物表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZpsta。（2）将重组表达载体转化到农杆菌感受态细胞EHA105中。以大豆的子叶节为外植体,采用农杆菌介导法转化大豆将目的基因hrpZpsta导入到大豆植株中。其中,以Jack为受体成活的再生植株158株,Williams82为受体成活123株,华春6号为受体成活229株,沈农9号为受体成活185株,总计得到抗性苗695株。（3）利用草甘膦涂抹法、PCR法、bar试纸条法对TO代转基因植株进行鉴定,且三种方法的鉴定结果表现均一致的抗性植株31株。其中以Jack为受体的阳性植株6株,Williams82为受体阳性植株12株,华春6号为受体的阳性植株3株,沈农9号为受体的阳性植株10株,总计31株。不同受体的转化率分别为5.06%,4.24%,1.24%,1.82%,本研究遗传转化的平均转化率为2.48%。种植T0代收获的种子于温室中,单株采用与T0代相同的鉴定方法,同一株系的种子混合收获。（4）对本研究已获得的转hrpZpsta基因的T2代大豆进行检测,经PCR检测,获得阳性株系19个,其中PCR检测阳性率大于50%的株系10个。采用下胚轴接种法对PCR阳性株系进行对疫霉根腐病抗性的鉴定,其中抗性与受体对照相比,抗性增强50%以上的株系有8个。对全部19个株系进行Southernblot分析,有效检测16个株系,其中单拷贝5个,双拷贝4个,三拷贝5个。结合PCR阳性率、株系抗病性、Southernblot分析结果及株系后代群体的大小,获得了转hrpZpsta基因大豆抗大豆疫霉根腐病的优势转基因种质材料3份,株系编号为B4J9116、B4J8049及B4J9127,其中B4J9116为单拷贝,B4J8049为三拷贝,B4J9173为5拷贝。（5）继续对本研究已获得的转hrpZpsta基因的T3代抗大豆疫霉根腐病的优势转基因种质材料在抗病性鉴定和PCR检测的基础上进行筛选。利用PCR检测,获得了PCR检测阳性率达100%的后代阳性株系7个,分别为B4J9116-6、B4J8049-4、B4J8049-6、B4J8049-9、B4J8049-10、B4J8049-11及B4J9127-28。分别对来自三个株系的5个单株进行Southernblot分析,其中来自B4J9116-6株系的5个单株均为单拷贝,证明hrpZpsta基因整合到大豆基因组中,并可以稳定遗传。来自B4J8049-5株系的单株B4J8049-5-1、B4J8049-5-2 Southernblot检测均为单拷贝,B4J8049-5可作为后续筛选的重点株系。（6）利用反转录-PCR检测目的基因在T3代植株中的表达,利用Western blots分析检测目标基因在T3代植株中的蛋白质翻译。随机单株采样检测,B4J9116-1-9、B4J9116-6-2、B4J8049-5-1、B4J8049-9-1、B4J9127-20-17、B4J9127-40-26等6个单株在转录和翻译水平上均有表达。（7）通过连续3代的生物学功能鉴定及分子鉴定,获得了单拷贝、可以稳定遗传,且抗病性明显提高的转基因株系B4J9116-6。烟草野火病原菌中hrZpsta基因的转化对大豆对疫霉根腐病的抗性有调节作用,并使得一些复杂的生理生化性状得到进一步的改良,但该基因对改善大豆对其他病害的抗性、抗虫和其他有益性性状是否存在影响?转入基因hrpZpsta的大豆的许多性状诸如产量、品质、抗性,植株的形态、熟期、花器发育的调节是否会发生改变?这些疑问都是研究植物基因工程中需要进一步回答的问题。