【摘 要】
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目的 建立稳定敲除Tip60基因的细胞系.方法 拼接特异识别特定序列的TALEN质粒由北京大学张博教授赠送.首先根据Tip60基因序列并结合生物信息学设计TALEN质粒对；根据设计的序列拼接相应的TALEN质粒识别序列；然后将上下游识别序列分别插入TALEN质粒使得识别序列与内切酶Fok l融合表达.TALEN质粒对构建成功并测序验证后,提取质粒.采用上述质粒对共转染293细胞,共转染48h之后提
【机 构】
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军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850
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目的 建立稳定敲除Tip60基因的细胞系.方法 拼接特异识别特定序列的TALEN质粒由北京大学张博教授赠送.首先根据Tip60基因序列并结合生物信息学设计TALEN质粒对；根据设计的序列拼接相应的TALEN质粒识别序列；然后将上下游识别序列分别插入TALEN质粒使得识别序列与内切酶Fok l融合表达.TALEN质粒对构建成功并测序验证后,提取质粒.采用上述质粒对共转染293细胞,共转染48h之后提取细胞基因组DNA.采用相应的引物PCR扩增含有切割位点的基因序列并克隆到T载体,继而采用两步PCR方法检测Talen质粒对的切割效率.选择具有较高切割效率的TALEN质粒对转染293细胞,48 h后将细胞系稀释至96孔板培养,使每孔理论上只有一个细胞.培养3～4周传至12孔板扩增培养数天,提取单克隆细胞基因组,采用PCR技术扩增靶片段并进行酶切鉴定,从而筛选出稳定敲除Tip60基因的细胞系.结果与结论 已经筛选出可以对靶位点进行高效切割的TALEN质粒对,并利用该质粒对转染293细胞,成功筛选出单位点稳定敲除Tip60基因的293细胞系.
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