急性心力衰竭大鼠心肌组织蛋白质组学改变研究背景心力衰竭(Heart Failure,HF)为各种心脏病的终末衰竭阶段,是由于心脏结构或功能异常导致心脏收缩和舒张功能障碍所致的一组复杂临床综合征,其主要临床表现为呼吸困难、心悸、水肿、运动耐力下降,乏力。心力衰竭发病率高,致死率高,已成为21世纪最重要的心血管病症。目前认为心力衰竭的发病原因主要是(1)急性、慢性缺血引起心肌细胞坏死、顿抑、凋亡,使得缺血区心肌细胞丢失和功能丧失;(2)心脏负荷过重引起的血流动力学负荷过重;(3)与遗传缺陷、病毒感染等因素有关的心肌病,病毒性心肌炎导致的心肌细胞丢失和功能丧失。(4)神经内分泌过度激活1.肾素—血管紧张素—醛固酮系统;2.交感神经儿茶酚胺系统。目前对于心力衰竭的治疗主要在于(1)改善血流动力学,提高心脏收缩和舒张性能。临床应用强心、扩张血管、利尿等药物进行治疗,血流动力学的改善仍然是目前指导急性心力衰竭治疗和评价治疗效果的主要方法。(2)拮抗过度激活的神经内分泌系统及细胞因子。神经内分泌系统目前心力衰竭药物治疗的主要靶点。循证医学检验发现血流动力学作为治疗靶点的治疗方法被证实绝大多数是失败的,而且即便是β受体阻滞剂,利尿剂、ACEI及植入性器械(CRT或CRT-D)等应用在心衰治疗中取得巨大进展,患者心衰症状最终仍会不断加重,5年内死亡率为50%,10年内死亡率为90%。因此在临床工作中迫切需要寻找新的药物靶点及理论支持,来明确诊断、指导治疗和判断预后。研究发现急性心衰时心肌能量合成明显下降,是否能通过改善能量代谢,改善心脏能量饥饿状态治疗心力衰竭成为心衰治疗的新思路。心肌的收缩和舒张是个主动耗能的过程,心肌的能量合成主要由三个阶段形成(1)产能底物的利用-游离脂肪酸/葡萄糖途径;(2)心肌细胞线粒体内氧化磷酸化过程;(3)ATP的转运和利用。脂肪酸、乳酸、葡萄糖、酮体、丙酮酸及氨基酸等都是提供能量的底物。在正常情况下,心肌所需能量的60%-90%来自游离脂肪酸的β氧化,经过β氧化,转变成乙酰辅酶A,而葡萄糖经过醣酵解产生丙酮酸,乳酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成丙酮酸,最后在丙酮酸脱氢酶(PDH)作用下,均转变成乙酰辅酶A,进入三羧酸循环产生ATP,提供能量。在线粒体中,三羧酸循环产生的电子(NADH+H+和FADH2)通过线粒体内呼吸链复合物氧化磷酸化,使ADP磷酸化,产生ATP。ATP中的高能磷酸键与肌酸结合,形成磷酸肌酸。磷酸肌酸可以弥散到肌纤维中,在肌酸激酶的催化下,重新释放出ATP,提供心肌收缩和舒张的能量。心脏可以将储存在脂肪酸和葡萄糖中的化学能转化为心肌纤维中肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的机械能。心力衰竭重度心肌缺血时,游离脂肪酸和葡萄糖的氧化均受到抑制,氧化磷酸化过程受损,磷酸肌酸水平可降低30%-70%,同时肌酸转运体功能也降低。此时心肌细胞存活依赖葡萄糖酵解提供的少量ATP。改善心肌的能量代谢可能是心衰治疗的新思路,目前对心力衰竭时心肌能量代谢改变的研究非常多。为了更详尽的了解急性心力衰竭发生时心肌细胞能量代谢的改变和与心肌收缩相关的特异蛋白质改变,寻找新的药物治疗靶点和简单、实用、特异性强的生物标志物用于心衰的早期诊断、鉴别诊断、指导治疗和判断预后,我们使用质谱方法进行了急性心力衰竭大鼠蛋白质组学研究。质谱方法是蛋白质组学研究的高通量实验技术,质谱分析可提供微生物的肽模式、寡聚核苷酸的分子量、氨基酸序列、低聚核苷酸分子量、结构蛋白图谱、差异蛋白比较等信息,找到与某些疾病相关的特异性的异常功能蛋白质,为疾病诊断提供分子生物标志物(biomarker)。LTQ-Orbitrap,是把多级线性离子阱和高分辨质谱结合的质谱仪,具有高样品通量,高分辨能力,质量精度,高灵敏性,高速,稳定可靠的特点,可被用于常规分析检测、蛋白质、药物分析及研究小分子化合物结构,提高了对物质成分和结构鉴定的能力。LTQ-Orbitrap可对蛋白质酶切后肽段的分子量和二级质谱同时测定,再经过数据库检索,得到蛋白质的差异定量鉴定,还可一次鉴定多种蛋白质,是蛋白组学、食品安全、毒物鉴定及代谢组学等研究领域中是不可缺少的手段。LTQ-Orbitrap可通过ICAT、I-Traq、SILAC和无标记肽离子流图等各种定量模式,进行差异蛋白定量分析鉴定,寻找特异性生物分子标记物。Orbitrap扫描具有高质量精度(<3ppm),和高质量稳定性(<0.3ppm)。LTQ-Orbitrap仅通过数微克的蛋白质样品,就可以检测到大量的蛋白质变化,用于蛋白质的鉴定与筛选,广泛应用于基础研究,具有高稳定性、定量精确、微克的样品检验量可获得大量的信息,重复性高,并可同时对多种不同样本进行定量分析。它可以鉴定任何类型的蛋白质。为进行蛋白质组学提供了一个可靠的、灵敏的科学平台体系。研究目的1.分组并且建立大鼠心肌梗死模型:(1)正常对照组:(2)第一天组:冠状动脉结扎后不做任何治疗。(3)第十四天组:冠状动脉结扎后没有行任何治疗。2.LTQOrbitrap质谱用于研究在AMI后14天组、1天组和对照组的差异蛋白表达。利用蛋白质分析系统 Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析。研究方法实验动物模型的建立与分组:1.24只清洁级雄性Wistar大鼠(12-14周龄;250-300 g),动物检验合格,适应性饲养1周后,动物随机分为3组,每组8只。(1)正常对照组:(2)第一天组:冠状动脉结扎大鼠不做任何治疗。(3)第十四天组:冠状动脉结扎后没有行任何治疗。1天、2周后,大鼠行安乐死,留取各组大鼠血液及心肌组织标本。2.组织标本病理学检测对心肌组织切片行苏木素-伊红(H&E)染色、观察心肌细胞肥大肿胀、心肌纤维排列不规则、细胞核畸形,白细胞浸润,免疫组织化学染色检测Cav1.3抗体,Gelsolin抗体,VDBP抗体,Myosin-7抗体在各分组心肌组织内表达。3.Western Blot 检测收集各组心肌组织提取蛋白,Western Blot法检测在1天组、14天组和正常对照组中左心室心肌组织中Cav1.3抗体,Gelsolin抗体,VDBP抗体,Myosin-7抗体表达。4.LTQ Orbitrap 质谱LTQOrbitrap质谱用于研究在AMI1天组、14天组和正常对照组的差异蛋白表达。利用蛋白质分析系统Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析,寻找与急性心力衰竭大鼠心功能发生改变有关的能量代谢相关蛋白、钙调节和收缩功能相关的蛋白质质谱改变。5.统计分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,多组数据采用单向方差分析用于统计学分析,两两比较采用Turkey’s多比较试验。P<0.05被认为有统计学差异。研究结果:1.心肌梗死后大鼠心脏蛋白质组学研究发现了与能量代谢相关的蛋白质出现明显下调14天组与对照组之间表达的差异蛋白主要是与能量代谢(包括糖酵解、线粒体三羧酸循环和脂肪酸β-氧化关键酶),心肌收缩功能[β肌球蛋白重链异构体(Myosin-7)]、钙处理(凝溶胶蛋白,Cav1.3,Galectin-3 和 VDBP),心肌病理性肥大(Gelsolin和Myosin-7)和心脏重塑(纤维蛋白原β链)密切相关。2.急性心肌梗死发生后的不同时间点(术后1天和14天)的差异蛋白的表达有动态变化。Cav1.3抗体,Gelsolin抗体,VDBP抗体,Myosin-7抗体可作为诊断及预测病情变化的分子标志物。在急性心肌梗死发生后的不同时间点(术后1天和14天)的差异蛋白的表达有动态变化。例如,Myosin-7表达量在急性心衰发生后1天无明显改变,但是在心衰发生后14天明显上调,考虑与心力衰竭进展有关。研究结论1.AMI后,大鼠心脏蛋白质组学研究发现各组差异蛋白表达主要是与能量代谢,心肌收缩功能、钙处理,心肌病理性肥大和心脏重塑密切相关。2.急性心肌梗死发生后的不同时间点(术后1天和14天)的差异蛋白的表达有动态变化。Cav1.3抗体,Gelsolin抗体,VDBP抗体,Myosin-7抗体可作为诊断及预测病情变化的分子标志物。3.LTQ Orbitrap质谱研究方法用于心肌梗死后急性心衰的蛋白质组学研究,是一种可靠的方法。提高急性心力衰竭大鼠受损心肌S100A1水平蛋白质组学研究研究背景心血管疾病是全世界死亡的主要原因,其特点是高致残率和死亡率。急性心肌梗死是冠心病死亡的首要原因,AMI后由于心肌重构会引起梗死区室壁变薄、非梗死区室壁代偿性增厚,心室扩张,引起心衰、心律失常、血栓形成。心力衰竭时S100A1蛋白表达减少,S100A1基因敲除组小鼠出现心肌收缩功能受损,心肌细胞凋亡,心室重构、扩张,心力衰竭,死亡率达到80%以上。在以前的研究中,给大鼠异丙肾上腺素过量(iso-ov)注射,大鼠心尖遭受缺血再灌注损伤与心律失常,随后出现心脏重塑和急性心功能障碍。在两个星期后,心肌细胞表现出收缩和舒张功能紊乱,线粒体功能障碍可能会降低心脏收缩力,ATP耗竭和氧化应激加剧。虽然随着医疗技术的发展,大部分急性心肌梗死患者得到了及时救治,但目前我国城乡居民总死亡原因的首位仍为心血管疾病。如何寻找新的有效的治疗方法已经成为目前研究的重点。随着生命科学的发展,靶向基因治疗的可行性逐渐明确。S100钙结合蛋白A1(S100A1)是心脏血管功能的重要调节器,是钙传感蛋白,参与Ca2+信号转导通路,参与基因表达,分泌,细胞凋亡,细胞分化,肌肉收缩等过程。S100A1与肌浆网ATPase(SERCA2a)和兰尼碱受体2(RyR2)相互作用,这主要结果在改善Ca2+的调节和肌肉收缩功能。S100A1蛋白表达增加可明显提高衰竭心肌的心肌收缩、舒张功能,心肌细胞“复苏”。S100A1转基因组小鼠S100A1的表达增加,心肌细胞凋亡减少,保持了心肌细胞内Ca2+转运的动态平衡,心脏射血功能改善,独立于β肾上腺素能受体,阻止了心室重构的发生,逆转了心力衰竭的进展,急性心肌梗死后死亡率明显下降。S100A1蛋白有高度的组织特异性,在健康左心室心肌细胞中大量表达,右心室和心房表达较少。S100A1与SERCA2a、RyR2在心肌细胞内共存,并参与调控肌浆网SERCA2a和RyR2的功能。S100A1通过增加Ca2+诱导Ca2+释放(CICR)降低舒张期钙超载和短暂提高及通过减少舒张期肌浆网钙渗漏改善心肌细胞功能。(1).调控肌浆网SERCA2a功能。(2).调控RyR2功能。S100A1与RyR2和SERCA蛋白复合物相互作用。增加S100A1蛋白水平可通过RyR2增加收缩期SR Ca2+的释放,而没有影响LTCC活动。此外,在舒张期RyR2通道关闭,S100A1减小Ca2+幅度,以减少SR释放Ca2+,低Ca2+状态下还能与与RyR2受体的C末端直接作用,抑制RyR2受体的开放,减少Ca2+渗漏,从而减少舒张期Ca2+瞬变的频率、幅度和持续时间。S100A1蛋白通过减轻舒张期胞质Ca2+超载,改善线粒体功能,对磷酸肌酸和ATP比率的恢复起重要作用。钙结合蛋白S100A1在心脏的功能效应还包括抑制心脏重构。S100A1作为心肌收缩功能的调节器,减轻生物机械性负荷,逆转心室构;可直接抑制细胞外基质基因、al-肾上腺素能介导的胎儿基因等基因的失控表达,维持正常的基因表达,从而减轻心室肥厚和心脏扩张。S100A1作为缺血后组织血管再生的内皮细胞调节器,促进心功能恢复,抑制心肌细胞凋亡。S100钙结合蛋白Al(S100A1)是心肌收缩力的重要调节因子。对S100A1如何影响心肌能量代谢,急性心肌梗死(AMI)后的钙结合蛋白和细胞骨架蛋白的变化的了解仍相对有限。LTQ Orbitrap质谱是一种蛋白质定量检查方法。本研究使用LTQ Orbitrap质谱方法对S100A1转基因大鼠急性心肌梗死后与能量代谢相关的蛋白质表达,钙结合蛋白和细胞骨架蛋白表达进行研究,寻找新的治疗方向与治疗方法。本研究的目的是通过对(Ad-S100A1-EGFP)大鼠急性心肌梗死(AMI)模型的研究,进一步明确S100A1对心肌能量代谢关键酶的作用,以及如何影响钙结合蛋白,改善受损心肌的收缩功能。LTQ Orbitrap质谱用于研究在AMI后Ad-S100A1-EGFP组和对照组的差异蛋白表达。利用蛋白质分析系统 Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)进行分析。研究目的1.建立大鼠心肌梗死模型并分组,Ad-S100A1-EGFP组,结扎后冠状动脉20分钟后,1×10PFU20μL Ad-S100A1-EGFP注入左心室前壁(LV)。2.明确S100A1对急性心肌梗死后心力衰竭心功能恢复有保护作用3.LTQ Orbitrap质谱用于研究在AMI后Ad-S100A1-EGFP组和对照组的差异蛋白表达。利用蛋白质分析系统Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析。研究方法1.实验动物模型的建立与分组总共20只雄性Wistar大鼠(12-14周龄;250-300 g),动物检验合格,适应性喂养7天,称重后动物们随机分为4组(5只大鼠/组)如下:1.Ad-S100A1-EGFP组,结扎后冠状动脉20分钟后,1×10PFU 20μL Ad-S100A1-EGFP注入左心室前壁(LV)2.对照组仅结扎冠状动脉没有任何治疗;3.Ad-EGFP组,结扎冠状动脉20分钟后,1×1010PFU Ad-EGFP20μL分别注入左心室前壁;4.生理盐水组,结扎后冠状动脉后20 min,20μL生理盐水左心室前壁注射。2周后,大鼠行安乐死,留取各组大鼠血液及心肌组织标本。2.组织标本病理学检测对心肌组织切片行苏木素-伊红(H&E)染色、masson染色及苦味酸-天狼猩红特殊染色观察术后大鼠心肌细胞形态、心肌细胞肥大肿胀、心肌纤维排列不规则、细胞核畸形,白细胞浸润,心肌纤维胶原含量百分比。免疫组织化学染色检测cTnI、MLC 3和HSP70在心肌组织内表达。3.Western Blot 检测收集各组心肌组织提取蛋白,Western Blot法检测在Ad-S100A1-EGFP组左心室心肌组织中cTnI、MLC 3和HSP70的表达。4.LTQ Orbitrap 质谱LTQ Orbitrap质谱用于研究在AM1后Ad-S100A1-EGFP组和对照组的差异蛋白表达。利用蛋白质分析系统Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析,寻找提高急性心力衰竭大鼠受损心肌S100A1水平后与心功能改变有关的能量代谢相关蛋白,12个Ca2+结合蛋白和22个细胞骨架蛋白。5.统计分析。应用SPSS 18.0软件分析处理数据,多组数据采用单向方差分析用于统计学分析,两两比较采用Turkey’s多比较试验。P<0.05被认为有统计学差异。研究结果1.提高受损心肌S100A1水平抑制了心室重塑在对照组心梗后,心脏形态和结构发生明显变化,表现为心/身重量比(HW/BW)增加,心肌组织明显水肿、左心室壁变薄,左室明显扩张,镜下观察,HE染色显示心肌细胞肥大,排列紊乱,多有炎症细胞浸润,细胞间隙增加,水肿;Ad-S100A1-EGFP注射组标本心肌纤维排列较整齐;Masson染色及天狼猩红染色结果显示心梗后心肌组织中胶原沉积增加,排列紊乱,心梗后大鼠心肌组织中1型胶原、Ⅱ型胶原表达增加。Ad-S100A1-EGFP注射组胶原纤维染色较对照组明显减少,多见Ⅰ型胶原纤维。Western blot结果显示心肌组织中cTnI、MLC 3和HSP70表达增加,与免疫组织化学染色及LTQ Orbitrap质谱结果一致。2.提高受损心肌S100A1水平改善了心肌能量代谢根据LTQ Orbitrap质谱结果,利用蛋白质分析系统Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析,Ad-S100A1-EGFP 组和对照组的对比中发现134个与能量代谢相关蛋白为差异蛋白,包括20个糖代谢相关和27个脂代谢相关蛋白。3.提高受损心肌S100A1水平改善了心肌收缩功能根据LTQ Orbitrap质谱结果,利用蛋白质分析系统Protein Analysis Through Evolutionary Relationships(PANTHER)分析,Ad-S100A1-EGFP 组和对照组的对比中发现12个Ca2+结合蛋白和22个细胞骨架蛋白,大多数的蛋白质表达在Ad-S100A1-EGFP组表达上调。研究结论1.AMI后,S100A1通过增加受损心肌能量代谢关键酶的表达改善心肌功能异常;2.AMI后,S100A1通过增加受损心肌Ca2+结合蛋白的表达改善心肌收缩功能异常;3.LTQ Orbitrap质谱研究方法用于心肌梗死急性心衰的蛋白质组学研究是一种可靠的方法。