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木聚糖酶是木聚糖降解酶系中最为关键的酶,在食品、饲料和造纸等多个行业中都有着重要的应用.从特殊环境筛选产酶菌株并得到优良性质的酶,现已成为木聚糖酶研究的重要手段之一.本课题从特殊环境来源菌株中一共克隆得到13条木聚糖酶基因片段,通过TAIL-PCR方法获得其中2个基因的全长,对其中的基因xynSL4进行异源表达和重组酶的酶学特性分析.研究结果如下:
1、以木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从大布苏盐碱湖、广西红树林、云南温泉、长富牧场堆肥和南海底泥这5个特殊环境中共筛选得到20株有透明圈且形态各异的菌株;从中克隆得到8条GH10和5条GH11木聚糖酶基因片段,其中6个片段的一致性在70～90％之间,3个GH10木聚糖酶基因片段的一致性小于80％.
2、通过TAIL-PCR方法得到2个盐碱湖分离菌来源的GH10木聚糖酶基因全长xynSL3和xynSL4，并对两个全长基因进行分析:①xynSL3共2259bp，编码752个氨基酸，包括预测信号肽、催化结构域和CBM结构域，与已知木聚糖酶的最高一致性为55%;②xynSL4共1143bp，编码380个氨基酸，包括预测信号肽和催化结构域，与已知木聚糖酶的最高一致性为77%。选择xynSL4作为下一步表达、纯化及性质研究的目的基因，并对XynSL4蛋白进行了氨基酸序列比对、三维结构预测及系统发育分析。
3、新木聚糖酶基因xynSL4在大肠杆菌中成功实现异源表达。经中空纤维浓缩、硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析对酶液进行浓缩纯化，对纯化的XynSL4进行酶学性质测定:①XynSL4最适反应pH为7.0，最适反应温度为70℃，在pH11.0下具有较好的稳定性(剩余酶活大于60% )，为嗜热耐碱木聚糖酶;②XynSL4在70℃下不稳定，木聚糖底物能够保护该酶在高温下所引起的构象改变;③XynSL4对高浓度NaCl具有很好的耐受性，在4 mol/L的NaCl溶液中稳定。β-巯基乙醇、Ca2+对酶活性有明显促进作用，而重金属离子和SDS对XynSL4具有显著抑制作用;④XynSL4对榉木木聚糖的Km、Vmax和Kcat分别为1.450.08 mg/mL,362.74±8.55μmol/(mg·min)和262.62±6.19 s-1;⑤产物分析表明:XynSL4是内切木聚糖酶，其主要水解产物是木糖和木二糖。