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研究背景在过去几十年里,在全世界范围内,糖尿病严重威胁到人类的健康。糖尿病患者,尤其是2型糖尿病患者,发生周围神经病变及心血管疾病等并发症的概率大大增加,最终可能导致死亡率大增加。大血管病变是2型糖尿病患者致残或死亡的主要原因,尤其是冠心病,其基本病理改变为动脉粥样硬化。越来越多的研究证实血管平滑肌细胞异常增殖、迁移、去分化等活动直接参与了动脉硬化的发生和发展。近年来多项研究显示仅靠单纯控制血糖并不能改善糖尿病合并心血管疾病患者的预后。胰岛素抵抗以及继发产生的高胰岛素血症(hyperinsulinemia,HIA)常见于2型糖尿病患者中,这些改变均可导致血管平滑肌细胞功能的改变。高浓度胰岛素可介导不同通路作用于血管平滑肌细胞改变其表型,如通过作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target oa Rapamycin,mTOR)及胰岛素样生长因子 1 受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R),以及其下游的ERK1/2,AKT,P70s6k通路等。然而,高浓度胰岛素导致VSMC功能改变的具体机制仍不十分明确。MicroRNA作为一种非编码小RNA几乎参与到所有的细胞生物学功能当中。现有研究显示,microRNA与代谢性疾病如:2型糖尿病、胰岛素抵抗等都有着密切的相关性。近期一些研究发现microRNA可能参与高浓度胰岛素诱导的VSMC表型转换及异常增殖等活动。MiR-99a作为一种新发现的与癌症相关的miRNA,既往研究已报道其可通过负调控靶基因mTOR及IGF-1R的表达水平发挥其抑癌作用,而这两个靶基因亦作为胰岛素通路的下游亦参与胰岛素的生物活性作用,miR-99a与胰岛素促进血管平滑肌细胞异常生物学功能的关系目前尚不明确。[目的]本研究将以小鼠原代血管平滑肌细胞为研究对象,旨在研究1、miR-99a是否参与调节高胰岛素促进的VSMC增殖、迁移、去分化;2、明确miR-99a参与调节高胰岛素诱导VSMC异常功能的机制3、miR-99a是否参与调节高胰岛素诱导的VSMC雷帕霉素抵抗并探讨可能机制。[方法]1、贴壁法原代培养C57/BL6小鼠主动脉血管平滑肌细胞;2、用CCK-8法检测不同浓度、时间胰岛素对血管平滑肌细胞活力的影响;3、q-RT-PCR检测不同浓度胰岛素作用于VSMC后对miR-99a表达的影响;4、采用lipofectamin2000法分别 miR-99amimic 及 NC,miR-99ainhibitor 及 NC 瞬时转染进 VSMC;5、用Brdu法检测过表达或抑制miR-99a表达后对VSMC增殖的影响;6、用流式细胞分析检测过表达miR-99a后对胰岛素促进VSMC周期转换的影响;7、用transwell实验检测过表达或抑制miR-99a表达后对高胰岛素促VSMC迁移的影响;8、用细胞划痕实验检测过表达或抑制miR-99a表达后对高胰岛素促VSMC迁移的影响;9、用Western blot实验检测过表达或抑制miR-99a表达后对高胰岛素促VSMC表型转换的影响,检测2个收缩表型蛋白及一个合成表型蛋白;10、采用生物信息学预测miR-99a潜在靶基因;11、q-RT-PCR检测miR-99a对IGF-1R 与 mTOR mRNA 表达的影响;12、Western blot 检测 miR-99a 对 IGF-1R与mTOR蛋白表达的影响以及对胰岛素促进IGF-1R与mTOR蛋白表达的影响;13.双荧光素酶实验验证IGF-1R与mTOR是否是miR-99a的靶基因;14、Western blot检测miR-99a对IGF-1R与mTOR下游信号通路的影响;15、CCK-8法检测胰岛素对雷帕霉素抑制血管平滑肌细胞活力作用的影响;16、BRDU法检测miR-99a能否恢复高浓度胰岛素所产生的雷帕霉素抵抗现象;17、transwell实验从细胞迁移功能检测miR-99a能否恢复高浓度胰岛素所产生的雷帕霉素抵抗现象;18、细胞划痕实验从细胞迁移功能检测miR-99a能否恢复高浓度胰岛素所产生的雷帕霉素抵抗现象;19、q-RT-PCR检测miR-99a对于高浓度胰岛素抑制P27kipmRNA表达的影响;20、WB检测miR-99a对于高浓度胰岛素抑制P27kip蛋白表达的影响。[结果]1、胰岛素以时间、浓度依赖方式促进VSMC增殖;2、高浓度(>100 nM)胰岛素可显著降低miR-99a的表达,但低浓度胰岛素无此作用;3、过表达miR-99a后可显著促进miR-99a表达水平,而抑制miR-99a后则可显著抑制miR-99a表达水平;4、过表达miR-99a后可抑制VSMC增殖并抑制胰岛素促进的VSMC增殖的作用,抑制miR-99a表达后可促进VSMC增殖并进一步促进胰岛素促进的VSMC增殖的作用;5、过表达miR-99a后可抑制胰岛素促进的VSMC细胞周期转换作用;6、transwell小室实验发现过表达miR-99a后可抑制VSMC迁移并抑制岛素促进VSMC迁移的作用,抑制miR-99a表达后可促进VSMC迁移并进一步促进胰岛素促进VSMC迁移的作用;7、细胞划痕实验发现过表达miR-99a后可抑制VSMC迁移并抑制岛素促进VSMC迁移的作用,抑制miR-99a表达后可促进VSMC迁移并进一步促进胰岛素促进VSMC迁移的作用;8、过表达miR-99a后可抑制胰岛素促进VSMC从收缩表型向合成表型转换,抑制miR-99a表达后可进一步促进胰岛素促进VSMC从收缩表型向合成表型转换;9、生物信息学预测IGF-1R与mTOR是miR-99a可能的靶基因;10、miR-99a负调控IGF-1R与mTORmRNA表达;11.MiR-99a负调控IGF-1R与mTOR蛋白表达;12、双荧光素酶实验验证IGF-1R与mTOR是miR-99a可的靶基因;13、过表达miR-99a后可抑制胰岛素促进AKT、ERK、P70S6K信号通路的激活;14、胰岛素可抑制雷帕霉素抑制细胞增殖的作用;15、miR-99a可恢复高浓度胰岛素下雷帕霉素抵抗的作用;16,miR-99a促进P27mmRNA表达;17、miR-99a促进P27蛋白表达,恢复高浓度胰岛素下雷帕霉素促进P27蛋白表达增多的作用。[结论](1)高浓度胰岛素可能通过负调控miR-99a表达激活mTOR,及IGF-1R,从而进一步诱发血管平滑肌细胞异常生物学功能。(2)过表达miR-99a可抑制高浓度胰岛素诱发的血管平滑肌细胞异常增殖、迁移、去分化等功能。(3)过表达miR-99a可通过调节P27kip1mRNA水平改善高浓度胰岛素所致VSMC雷帕霉素抵抗现象。