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许多研究已经证实,肿瘤患者循环外周血DNA与肿瘤组织DNA的突变具有一致性,又因为血液样本留取方便,可随时进行动态检测,因此循环外周血成为肿瘤突变检测较佳的替代的样本,而在循环外周血中实现肿瘤相关基因的检测也越来越成为技术研发人员所关注的热点。许多针对外周血检测的方法应运而生,但实际检测结果却差强人意。循环血中DNA总量偏低,且存在大量正常组织DNA的混杂,个体差异、肿瘤发生发展时期、治疗时期造成循环DNA的总量不定使得检测循环外周血基因的技术手段要求不需要依赖DNA浓度的判断,无需聚类对比,具备高特异性以及超高的检测灵敏度。现阶段还没有一种商业化的快速、简便的高灵敏度检测方案能够摆脱以上检测条件的限制,实现在外周血肿瘤标志基因的检测,这方面的研究工作还需要进一步探索。高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting analysis, HRM)利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同的原理,在PCR后直接运行高分辨熔解就可完成对样品突变分析。HRM技术作为一种闭管检测、简便快速、灵敏度高、重复性好、准确性高、可实现高通量检测的一种分型筛查方式,在临床推广上有着无可比拟的优越性。但是传统的HRM技术除了其技术本身存在的缺陷,还存在着对操作均一性要求较高,检测灵敏度、稳定性不高等问题,这些使得HRM技术的运用推广受到很大的限制。本实验旨在运用更高精度的HRM技术,并增加其灵敏度,降低判别难度,使其在临床运用上得到更好的运用。本实验发明了一种新的富集扩增的技术一Snapback primer ARMS (SP-ARMS),获得了近1000倍的富集效率,并将此新的高效富集扩增技术与HRM技术相结合,实现了万分之一甚至更高的检测灵敏度,满足了临床上对突变检测技术不易污染、灵敏性高、特异性强、简便易行、结果易判定的要求。随后我们将此技术成功运用于非小细胞肺癌患者组织和血浆样本EGFR/KRAS基因检测中,与组织测序和ADx-EGRR/KRAS检测试剂盒检测相比,具有更高的灵敏度和准确性。第一部分：弹回探针突变富集扩增技术(Snapback primer ARMS,SP-ARMS)的发明和弹回探针突变富集扩增高分辨率熔解曲线分析技术(SPA-HRM)体系的建立目的发明弹回探针突变富集扩增技术,实现对突变型模板高效率的富集扩增,达到对低频体细胞突变基因的检测的要求,且能与HRM技术进行无间断衔接,以实现一步化基因检测。方法通过检测EGFR、KRAS基因突变建立弹回探针高分辨率熔解曲线分析技术检测体系,在47例具有测序结果的非小细胞肺癌患者组织中进行检测体系特异性的验证。在此基础上发明弹回探针突变富集扩增技术(SP-ARMS),将突变型与野生型模板按照不同比例混合,经过普通PCR和SP-ARMS技术的富集扩增后.使用测序技术检测该技术的富集效率。之后结合弹回探针HRM检测,建立一步快速弹回探针突变富集扩增高分辨率熔解曲线分析技术(SPA-HRM)体系,并检测其灵敏度。结果经过组织测序鉴定,EGFR基因19号外显子缺失突变经SP-ARMS技术的富集扩增后,测序可以达到万分之一的灵敏度;L858R点突变和KRAS基因点突变经SP-ARMS技术的富集扩增后,可以检测到百分之一的突变。SPA-HRM检测系统在此基础上又将灵敏度提高了10倍。结论本实验发明了一种富集扩增的技术—Snapback primer ARMS,获得了高达1000倍的富集效率,是一项高效、简单易行、不需要提高任何检测成本的高效富集扩增方法,随之与Snapback primer HRM技术的结合,实现了千分之一到万分之一甚至更高的检测灵敏度。第二部分：在组织、循环外周血中运用弹回探针突变富集扩增高分辨率熔解曲线分析技术进行EGFR、KRAS基因突变的检测目的在非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织、循环外周血中运用SPA-HRM技术进行相关突变检测,与组织测序、ADX-EGFR/KRAS基因检测试剂盒相比,检测系统的准确性。方法收集NSCLC患者肺癌组织样本150例、其中有85例循环外周血样本与之相对应。通过引物探针的设计进行EGFR基因exon 19缺失突变、exon 21 L858R点突变和KRAS基因2号外显子第12、13密码子常见突变的检测。进行基因组DNA的抽提后,使用SPA-HRM技术检测的同时,使用测序技术和ADX-EGFR、KRAS基因试剂盒进行双盲检测,鉴定该检测技术的稳定性、准确性；探论血浆与血清样本对检测结果的影响,选择合适的样本量和样本抽提方式；结果在85例的NSCLC患者血液样本及相对应的组织样本检测中,测序法基因检测的阳性检出率为26%的,Scorpion-ARMS为46%,SPA-HRM则高达74%。结论本实验建立起来的SPA-HRM技术可以成功地进行非小细胞肺癌患者循环外周血中相关基因突变检测,与现下灵敏度最高的ADx-EGFR/KRAS基因检测试剂盒相比,与组织突变的一致性更高,灵敏性、准确性更好。是一项值得临床推广运用的一步、快速、低价、准确的组织和外周血DNA检测系统。