YAP通过p73上调Bax表达从而促进Aβ25-35诱导细胞凋亡的机制研究

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阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disea se,AD)是一种中老年常见的中枢神经系统退行性病变,有三大病理特征:淀粉样斑块沉积、神经纤维缠结和神经元大量丢失。近年研究表明,β淀粉样蛋白(β amyloid protein,Aβ)的沉淀是AD的重要病理学标志。Aβ可能通过激活细胞自身基因程序性表达,引发神经元凋亡,其导致细胞凋亡的具体机制并未研究清楚。以前的报道表明,p73对AD发病的过程的调节也是非常重要的。在Aβ诱导细胞凋亡过程中,通过激活c-Abl/p73途径,即c-Abl被Aβ激活,从而磷酸化激活p73,进而介导细胞凋亡。Yes-associatedprotein(YAP)是一个非常重要的转录共激活子(a transcription co-activator),作为转录共激活子,YAP必需从细胞质转位到细胞核中,结合转录因子,才能促进目的基因表达,从而发挥其生理功能。已报道的YAP的目标转录因子有p73,TEAD.Runx2和ErbB4细胞质结构域.YAP蛋白是p73发挥凋亡作用的一个重要的转录共激活子,通过各种方式与p73相互作用,能够大大促进p73对下游凋亡蛋白如Bax、Puma的转录从而促进细胞凋亡。YAP主要通过两个方面来促进p73介导的细胞凋亡:转录共激活p73和稳定p73。然而,对于YAP蛋白是否参与了Aβ诱导的细胞凋亡,以及YAP蛋白是否与p73在Aβ诱导的细胞凋亡过程中协同作用介导细胞凋亡,尚未有报道。   首先,我们通过共聚焦实时监测(real-time single-cell analysis)技术显示,GFP-YAP在Aβ诱导细胞凋亡过程中从细胞质转位到细胞核。为进一步证明YAP蛋白的核转位是与其功能相关的,我们运用Western Blotting技术,通过核质分离,证明了YAP的入核伴随着其酪氨酸357(Y357)的磷酸化水平的上升。   为了进一步证明内源YAP蛋白在Aβ诱导细胞凋亡过程中的功能,我们使用RNA干扰技术抑制YAP蛋白的表达。实验发现,YAP的干扰明显降低了Aβ诱导的细胞凋亡。这个结果表明YAP蛋白在Aβ诱导细胞凋亡过程中发挥了重要作用。   以上结果表明YAP蛋白参与了Aβ诱导细胞凋亡过程,接下来,我们试图证明YAP蛋白是如何参与Aβ诱导细胞凋亡。p73是一个广泛报道的YAP目标转录因子。我们通过运用FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)和免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation)技术发现,在Aβ诱导细胞凋亡过程中,YAP与p73发生相互作用,而且相互作用增强。这些结果表明,YAP蛋白通过与p73相互作用来调节Aβ诱导细胞凋亡。   为了进一步证明YAP与p73相互作用,参与了Aβ诱导细胞凋亡。我们检测了p73的目标转录因子Bax的表达与激活。我们通过转染YFP-Bax与GFP-YAP质粒,实验发现,YAP蛋白促进了Bax的转位即激活。为了进一步验证这个结论,我们分别运用了Western Blotting、Immunoprecipitation和免疫荧光(Immunofluorescence)技术对Bax的表达与激活以及caSpase-3的激活进行检测,实验发现,YAP的过表达促进了Bax的表达以及caspase-3的激活,干扰抑制YAP以后,Bax的表达与激活以及caspase-3的激活量明显减少。这些结果证明了YAP蛋白通过促进Bax的表达与激活以及caSpaSe-3的激活加速了Aβ诱导细胞凋亡。   综上所述,我们的研究首次发现YAP通过核转位来促进Bax的表达与激活,从而加速Aβ诱导细胞凋亡。因此,我们的研究提供了一个通过抑制YAP/p73/Bax信号通路来治疗AD的潜在方案。
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