论文部分内容阅读
原发性肝细胞癌（primary liver cancer，以下简称肝癌）是世界上第五大实体肿瘤，第三大癌症死因。迄今为止，外科切除和肝移植手术是早期肝癌的唯一治愈手段，在临床中，由于肝癌发展隐匿，病人发现时已是进展期肝癌，手术效果欠佳，往往采用以化疗为主的综合治疗。然而，肝癌患者易对化疗药物产生多药耐性（MDR），化疗效果差，因此寻求新型肝癌分子靶向治疗药物成为当务之急。分子靶向药物Bortezomib（曾用名Ps341），属于硼酸肽类化合物，选择性高，副作用小，它通过与蛋白酶体20S亚基直接结合并阻滞其酶的活性影响细胞内多个周期蛋白的降解，诱导细胞凋亡，从而起到抗肿瘤作用。有文献报道，Bortezomib作为第一个应用于临床的蛋白酶体抑制剂，目前已成功用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤，并被多个I期及II期临床试验证实能有效治疗肠癌等多种实体肿瘤，而Bortezomib应用于肝癌治疗的研究却很少。本实验拟采用五种肝癌细胞株为研究对象，通过观察Bortezomib对肝癌细胞增殖、侵袭转移以及凋亡的影响，探究其作用，并进一步探讨其可能机制。第一部分：Bortezomib对人肝癌细胞增殖、侵袭转移的影响目的：通过检测不同浓度Bortezomib对五种肝癌细胞系的增殖、侵袭转移能力影响，探究蛋白酶体抑制剂Bortezomib与肝癌细胞增殖、侵袭转移等生物学行为的相关性。方法：培养高转移能力的肝癌细胞系（MHCC97-H及M3细胞）及低转移能力的肝癌细胞系（HepG2、MHCC97-L及Huh7细胞）。使用MTT实验方法检测不同浓度蛋白酶体抑制剂Bortezomib对五种肝癌细胞的增殖抑制率。使用划痕实验及Transwell实验方法来探究Bortezomib对五种肝癌细胞生长、黏附、侵袭和迁移能力的影响，从而分析Bortezomib与肝癌细胞侵袭转移及凋亡的生物学行为的相关性。结果：用不同浓度的Bortezomib分别处理对数生长期的五种肝癌细胞株24h，48h，72h后，检测其对增殖、侵袭转移的影响并统计，其中MTT结果：Bortezomib可以明显抑制五种肝癌细胞株的增殖，与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；且随着剂量和时间的延长，抑制作用增强。划痕实验及Transwell实验显示：Bortezomib可以明显抑制五种肝癌细胞株的侵袭与迁移能力(P<0.01)，与对照组相比，差异有统计学意义，且抑制作用随剂量增加而增强。结论：Bortezomib抑制五种肝癌细胞系的增殖，负调控五种肝癌细胞系的侵袭转移，并呈时间、剂量依赖性。第二部分：探讨Bortezomib抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡的机制目的：通过观察Bortezomib作用下肝癌细胞凋亡情况及凋亡抑制蛋白XIAP及survivin表达情况，探讨Bortezomib抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡的作用机制。方法：使用PI和Annexin V-FITC双染流式细胞实验方法检测细胞凋亡情况，来探究Bortezomib对肝癌细胞凋亡的影响。使用Western blotting实验方法检测细胞中凋亡抑制蛋白XIAP及Survivin的表达，探究Bortezomib对凋亡抑制蛋白的影响。结果：流式实验结果提示：Bortezomib显著增加肝癌细胞凋亡率，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），并呈剂量依赖性。Western Blotting结果提示：Bortezomib降低肝癌细胞株中凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin的表达，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），并呈剂量依赖性。结论：Bortezomib可促使肝癌细胞凋亡发生，可能与凋亡抑制蛋白XIAP及Survivin表达降低有关，具体机制可能与泛素-蛋白酶体途径受抑制有关。