牙周炎是不可逆的牙周组织慢性炎症感染性疾病,发病率高,不分地域、民族和年龄,严重者可导致牙齿缺失,是危害口腔健康的第一杀手。吸烟是是牙周病的全身促进因素,吸烟者牙周炎的患病率是不吸烟者的四倍,且牙周组织的损伤更加严重。烟草中的主要毒性物质和成瘾源尼古丁,是一种来源于烟草植物叶子中的生物碱,其在促牙周炎发生发展中扮演着重要角色。课题组前期研究证实尼古丁可加速实验性牙周炎大鼠牙周组织破坏及牙槽骨的吸收,呈浓度依赖性。进一步研究发现,在大鼠牙周组织和人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)中均存在烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)的功能性表达,尼古丁特异性上调该受体表达,通过该受体激活下游的ERK、Wnt/β-catine、NF-κB等信号通路,进而调节细胞因子(IL-1β、IL-8、IL-6、IL-17、IL-21、TNF-α、MMP-1、MMP-3)等的表达,α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)是α7 nAChR特异性受体拮抗剂,可有效拮抗该效应。前期研究结果提示通过α7 nAChR,尼古丁可能加重吸烟相关性牙周炎牙周组织炎性损伤。自噬(autophagy)参与了牙周疾病的发生发展过程。nAChR作为尼古丁作用细胞的关键靶点,可通过调控多种细胞自噬水平参与机体的病理生理过程。目前有研究证实通过α7 nAChR,尼古丁可调控自噬参与神经系统疾病的发生发展,然而关于尼古丁调控α7 nAChR作用下自噬参与牙周疾病的可能作用及具体机制目前尚缺乏研究。本研究拟探索尼古丁、α7 nAChR、自噬与牙周炎的关系,为吸烟相关性牙周炎的预防及治疗提供新的理论依据。【目的】本课题拟从尼古丁调控hPDLCs自噬、α7 nAChR与自噬的关系、hPDLCs自噬与炎性因子关系等方面入手,系统探讨尼古丁可能通过α7 nAChR调控hPDLCs自噬水平,进而调节炎性因子表达参与牙周组织炎性损伤过程。进一步探索尼古丁促牙周炎发生发展的作用机制,从而为吸烟相关性牙周炎的临床预防及治疗提供新的理论依据。【材料和方法】1.采用酶解组织块法进行hPDLCs原代培养,观察细胞从组织块周围爬出,生长至培养器皿底壁80%时,常规细胞传代培养,第4代细胞进行细胞表型鉴定,第4-6代细胞用于后续实验。2.第4代hPDLCs以2×105/孔均匀铺于六孔板中,待细胞生长至80%后各孔给予含10-5mol/L尼古丁培养液,分别作用0、3、6、12、24 h;分别给予0、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的尼古丁培养液作用12 h。采用Western blot、免疫荧光法(immunofluorescence,IF)方法检测各组细胞中LC3Ⅱ和LC3蛋白表达情况,初步确定尼古丁诱导自噬最佳作用浓度及时间,透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)形态学观察在尼古丁诱导自噬最佳条件下,hPDLCs内自噬体的形成及数量变化。3.分别给予hPDLCs尼古丁(10-5mol/L)和/或α-BTX(10-8mol/L)处理12 h。采用Western blot、IF和TEM等实验方法检测各组细胞LC3Ⅱ和LC3蛋白表达及自噬体形成情况。4.分别给予hPDLCs尼古丁(10-5mol/L)和/或3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine,3-MA)(10-3mol/L)处理12 h。Western blot检测各组细胞LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达情况,RT-q PCR检测各组细胞IL-1β、IL-8 m RNA的表达水平,Elisa检测各组细胞上清中IL-1β、IL-8的分泌情况。【结果】1.体外成功培养出原代hPDLCs,待细胞生长至培养器皿底壁80%时,进行传代,流式细胞仪检测各组细胞表面标志物表达情况,实验结果表明,培养的细胞高表达CD146、CD105(间充质细胞表面标志物),低表达CD31以及CD14,说明培养的细胞来源于间充质组织。2.Western blot实验结果表明10-5 mol/L尼古丁作用于hPDLCs 3 h后,同空白对照组相比,LC3Ⅱ表达水平显著升高(P<0.05),且这一升高趋势在12 h达到高峰(P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达水平在尼古丁作用12h后基本趋于稳定。随着尼古丁浓度增加,hPDLCs LC3Ⅱ的表达随之明显增加,呈浓度依赖性。IF实验与Western blot实验结果一致,确定尼古丁诱导自噬最佳作用浓度(10-5 mol/L)及时间(12 h)。TEM实验验证在此最佳条件下,细胞内会产生大量自噬体。说明尼古丁能够诱导hPDLCs自噬的发生。3.Western blot、TEM、IF技术观察尼古丁和/或α-BTX作用于hPDLCs 12 h后自噬的变化。结果发现,α-BTX可拮抗尼古丁诱导的hPDLCs自噬发生,提示尼古丁可能通过α7 nAChR调控hPDLCs自噬。4.分析Western blot结果发现3-MA能够明显抑制尼古丁诱导的hPDLCs自噬发生。RT-q PCR、Elisa实验结果表明,尼古丁可显著增强hPDLCs分泌炎性因子1L-1β、IL-8的能力,而3-MA则能够明显抑制尼古丁对1L-1β、IL-8表达的上调效应,提示尼古丁可能通过调控hPDLCs自噬调节牙周组织炎性因子的表达。【结论】1.体外酶解组织块法成功培养出原代hPDLCs,细胞符合间充质来源特点;2.尼古丁能够诱导hPDLCs自噬发生,最佳诱导浓度及时间为10-5mol/L和12h;3.尼古丁可能通过α7 nAChR调控hPDLCs自噬;4.尼古丁可能通过调控hPDLCs自噬调节炎性因子的表达。