论文部分内容阅读
本文将5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）通过化学合成的方法连接在C60上得到新型光敏剂。5-ALA是一种无光毒性前药，可以在体内合成光敏剂原卟啉IX,从而选择性地杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞无损伤，是一种内源性光动力治疗药物。5-ALA-PDT具有方法简便,选择性高,毒副反应小等优点；但其水溶性极强，使其很难透过细胞膜进入细胞。而C60是一种十分理想的药物载体，而且其在抗肿瘤研究中取得了很好的成就；但C60严重的疏水性阻碍了其更好的应用和发展。因此，利用C60作为载体，与5-ALA结合形成水溶性纳米体系，利用EPR效应，可以在减少5-ALA用量的情况下增强光疗效果，增强药物的被动靶向性，增强对细胞的穿透力等。本文研究的主要内容分为两个部分：（1）、C60-5-ALA对体外培养黑色素瘤细胞的杀伤效果研究；（2）、C60-5-ALA对小鼠黑色素瘤模型的体内抑瘤效果研究。C60-5-ALA对体外培养黑色素瘤细胞的杀伤效果研究分为体外细胞摄取实验和体外抗肿瘤活性研究。①、体外细胞摄取实验选取恶性黑色素瘤细胞B16-F10作为细胞模型，考察该药物对细胞作用不同时间后PpIX产生情况。细胞爬片的荧光显微镜下观察显示2h时已经有红色荧光出现，说明此时已经有PpIX产生，4h时红色荧光强度增强，可以初步推断随着药物作用细胞时间延长，诱导产生PpIX含量逐渐升高。而高效液相分别考察了C60-5-ALA作用细胞时间和C60-5-ALA浓度对细胞内PpIX的含量的影响。结果显示C60-5-ALA作用细胞时间2h时，PpIX含量呈持续升高状态；C60-5-ALA的最适浓度为200μg/ml。②、体外抗肿瘤活性实验主要考察650nm激光对不同浓度的5-ALA和C60-5-ALA的细胞抑制作用。发现在5-ALA联合650nm激光照射时，细胞存活率均在75%以上，而C60-5-ALA联合650nm激光在20J/cm2的照射强度照射时，随着药物浓度的升高，细胞存活率逐渐降低，呈现浓度依赖性。当C60-5-ALA中所含5-ALA浓度为90μg/ml时，细胞存活率为45.44±5.22%，此时C60-5-ALA已经对B16-F10细胞已经产生明显的抑制作用。说明在同等浓度条件下C60-5-ALA较5-ALA有更好地细胞毒性(P<0.05)。C60-5-ALA对小鼠黑色素瘤模型的体内抑瘤效果研究主要包括小鼠黑色素瘤模型的建立、体内抑瘤效果研究、冷冻切片及组织内PpIX产生及含量测定和病理学考察。①、小鼠黑色素瘤模型的建立中成瘤率为97.37%；②、体内抑瘤效果研究实验主要考察小鼠的生活情况和体积随时间的变化，显示C60-5-ALA（含5-ALA30mg/kg）组肿瘤增值率为7.41%；5-ALA（30mg/kg）组肿瘤增值率为39.93%；两者之间存在显著性差异（P<0.05)。说明该给药浓度下C60-5-ALA抑瘤效果优于5-ALA。③、冷冻切片及组织内PpIX含量测定中首先通过对C60-5-ALA光照组和5-ALA光照组瘤部位制作冷冻切片，可以直观地观察到C60-5-ALA组瘤部位有红色荧光出现，而5-ALA组瘤部位红色荧光却不太明显。说明C60-5-ALA组瘤组织中有PpIX产生。而PpIX含量测定主要通过小鼠尾静脉注射C60-5-ALA和5-ALA后其心、肝、脾、肺、肾和瘤各个组织中PpIX产生含量的不同来定量检测PpIX聚集部位。结果显示C60-5-ALA组小鼠瘤中产生量最多，其他脏器产生量较少，心、脾中几乎没有；5-ALA组瘤部位PpIX产生量明显低于C60-5-ALA组。说明C60-5-ALA作用后PpIX主要聚集在瘤部位；④、病理学主要通过石蜡切片考察，结果显示C60-5-ALA作用后小鼠瘤组织细胞大面积坏死，而其他组织细胞损伤较小，说明PpIX在瘤部位聚集量较多，发挥了一定的药效学效应。