论文部分内容阅读
研究背景和目的：淋巴细胞微粒（lymphocyte-derived microparticels，LMPs）[1]是当淋巴细胞受刺激凋亡或活化时从浆膜上脱落形成的小囊泡颗粒,其直径约0.05-1.0μm。LMPs作为细胞间传递生物信息的重要介质，有多种生物学活性，例如促进炎症反应[2]、调节免疫反应[3][4]、调节血管张力[5][6]、调节血管生成[7][8][9]等。LMPs参与炎症反应时，通过促进多种炎症介质释放、粘附分子表达而实现其生物学效应。临床研究发现COPD患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中存在着病理性升高的LMPs，且LMPs的量和疾病的严重程度密切相关。在COPD患者缓解期和急性发作期诱导痰中和血清中均发现升高的IL-1β，和气道阻塞的严重程度正相关，与FEV1/FVC%呈显著负相关[10]。Imaoka等[11]和Hoshino等[12]亦证实IL-18的过表达参与了COPD的发病进程。我们课题组首次发现，LMPs在体外可以诱导人支气管上皮细胞释放IL-1β、IL-6和IL-18等细胞因子，并能导致上皮细胞凋亡[13]。可见，IL-1β和IL-18在COPD气道炎症中起着极其重要的作用。因此，我们推测LMPs与气道炎症密切相关，但LMPs在体内能否诱导气道炎症以及相关的炎症机制尚不清楚。本研究拟通过LMPs诱导建立BALB/c小鼠气道炎症模型，并通过评价小鼠气道及肺部炎症水平来探讨LMPs在气道炎症发生中的作用，为进一步探讨LMPs与气道炎症的关系提供新的线索和基础研究，进而为临床防治气道炎症，尤其是COPD、哮喘等气道炎症提供新的干预靶点和方向。方法1. LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型的建立1.1LMPs制备首先进行T淋巴细胞白血病细胞株(6T-CEM)培养，于底面积25cm2的培养瓶中培养细胞，在细胞状态良好的情况下，加入终浓度为0.5μg/ml的放线菌素D溶液(actinomycin D)处理6T-CEM细胞24h[14]。然后离心细胞，收集细胞培养上清，于12000g/min低温离心机离心50min×3，取沉淀，PBS重悬，得到LMPs重悬液。流式细胞仪对LMPs进行鉴定，测定LMPs蛋白浓度。1.2LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型的建立1.2.1LMPs致炎模型最佳诱导浓度的筛选24只雌性BALB/C小鼠随机分为4组（每组n=6）：正常对照组A组和根据药物浓度分诱导炎症B组（20μg/ml）、C组（50μg/ml）、D组（150μg/ml）。致BALB/c小鼠气道炎症，收集各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）检测细胞计数，ELISA法检测小鼠气道内的IL-1β、IL-18表达水平；根据不同组细胞计数的数量及IL-1β、IL-18的表达水平的差异，选择LMPs最佳诱导浓度。1.2.2LMPs致炎模型最佳诱导时间的筛选24只雌性BALB/C小鼠随机分为4组（n=6）：正常对照组(A组）、LMPs处理12h组（B组）、24h组（C组）、48h组（D组）。在LMPs最佳诱导浓度下分别诱导小鼠0h，12h，24h，48h后，收集各组小鼠BALF检测细胞计数，ELISA检测各组IL-1β、IL-18表达水平；根据不同组细胞计数的数量及IL-1β、IL-18表达水平的差异，选择LMPs最佳诱导时间。1.2.3组织病理学检测：HE染色法观察LMPs处理后的BALB/c小鼠的支气管和肺组织的变化情况。2. LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型的相关指标检测及评价2.1收集小鼠BALF检测细胞计数、细胞吞噬功能在LMPs最佳诱导浓度、最佳诱导时间条件下致炎小鼠气道模型，收集小鼠BALF检测细胞计数，检测细胞吞噬功能。2.2小鼠BALF中IL-1β、IL-18表达水平检测在LMPs最佳诱导浓度，最佳诱导时间条件下致炎小鼠气道模型，ELISA检测小鼠气道内IL-1β、IL-18，观察处理组IL-1β、IL-18变化。2.3相对定量PCR和Western blot检测肺组织中NLRP3、TLR4、IL-18和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平实验分为2组，每组4个BALB/C小鼠样本，其中A-1， A-2，A-3，A-4为正常小鼠的肺组织，B-1，B-2，B-3，B-4表示小鼠经过最佳诱导浓度的LMPS灌肺后，在最佳诱导时间后取材的肺组织。RT-PCR和Western blot分别检测肺组织中NLRP3、TLR4、IL-18和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平，观察变化情况。结果：1. LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型的建立1.1经LMPs处理后小鼠BALF中细胞数量较对照组逐渐增多，20μg/ml LMPs诱导时轻度增高，50、150μg/m1LMPs诱导时细胞计数明显增高且稳定。正常组BALB/c小鼠气道内低表达IL-1β、IL-18；20μg/ml LMPs诱导后IL-1β、IL-18表达水平有所升高，而50、150μg/m1LMPs诱导时IL-1β、IL-18表达水平最高并较为稳定。故LMPs诱导小鼠气道炎症的最佳浓度为50μg/ml。1.2在50μg/ml最佳诱导浓度下，小鼠BALF中细胞数量较正常组逐渐增多，12h诱导时轻度增高，24h、48h诱导时细胞计数增高且稳定；正常组小鼠气道内低表达IL-1β、IL-18；LMPs诱导12h时产生的IL-1β、IL-18有所升高，LMPs诱导24h和48h时促炎因子IL-1β、IL-18表达最高并较为稳定。故LMPs诱导最佳时间点为24h。1.3组织病理学观察：经LMPs处理组小鼠肺组织中淋巴细胞显著聚集，部分支气管出现管腔纤维化、闭塞。2. LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型的相关指标的检测及评价2.1气道炎症模型小鼠BALF中细胞数量较正常组明显增多(P<0.01)；细胞吞噬数比正常组明显增多(P<0.01)。2.2模型小鼠BALF中， IL-1β检测值为45.40±0.40pg/ml，正常组为1.56±0.20pg/ml，两组间存在显著统计学差异(P<0.01)；IL-18检测值为639.46±7.92pg/ml，而正常组为29.17±2.35pg/ml，两组间也存在显著差异(P<0.01)。2.3模型小鼠肺组织NLRP3、TLR4、IL-1β及IL-18mRNA表达水平较正常组均有不同程度升高，且NLRP3、TLR4mRNA上升水平更为明显（P＜0.01）。2.4Western blot检测模型小鼠肺组织NLRP3、TLR4、IL-18及IL-1β蛋白质在不同分组中的表达情况，其表达水平与mRNA水平表达趋势相一致。结论：1.本研究成功建立了LMPs致BALB/c小鼠气道炎症模型，LMPs致小鼠气道炎症模型最佳诱导浓度为50μg/ml，最佳诱导时间为24h。2.体内实验研究初步证实LMPs能够引起小鼠气道内IL-18、IL-1β的表达升高，肺组织中淋巴细胞显著聚集，部分支气管出现管腔纤维化、闭塞；提示淋巴细胞微粒能导致气道炎症，在诱导小鼠气道炎症过程中发挥着促炎的作用。3. LMPs处理后小鼠BALF中细胞数量明显增多，细胞吞噬明显增强；提示LMPs可能通过促进气道局部炎症细胞的聚集，活化吞噬细胞而发挥致炎作用。4. LMPs导致气道炎症发生可能是通过上调NLRP3、TLR4的表达，导致IL-1β、IL-18释放过多来实现的。