【摘 要】
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猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种急性传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗接种在很大程度上有助于PRV从猪群中根除。经典的减毒活疫苗PRV Bartha-K61已被证明是一种既安全又高效的疫苗,在PR的控制中发挥了关键作用。在减毒活疫苗的生产过程中,病毒滴度的提高有助于减少生产成本,提高产能,促进我国养猪业的健康稳定发展。病毒复制需要依赖于细胞作为场所,而细胞死亡则可以阻止病原体复制周
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猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种急性传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗接种在很大程度上有助于PRV从猪群中根除。经典的减毒活疫苗PRV Bartha-K61已被证明是一种既安全又高效的疫苗,在PR的控制中发挥了关键作用。在减毒活疫苗的生产过程中,病毒滴度的提高有助于减少生产成本,提高产能,促进我国养猪业的健康稳定发展。病毒复制需要依赖于细胞作为场所,而细胞死亡则可以阻止病原体复制周期的完成,从而抑制病毒的增殖。研究发现,程序性坏死在抵抗病毒感染中具有重要作用,程序性坏死的激活依赖于RIPK3和MLKL的信号级联反应。实验室前期研究已发现,伪狂犬病毒感染可诱导程序性坏死通路的活化。在此研究基础上,为了构建可促进PRV Bartha-K61增殖的细胞株,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了MLKL基因和RIPK3基因缺失的PK-15细胞株,进一步研究了MLKL/RIPK3基因缺失PK-15细胞株对PRV Bartha-K61增殖能力的影响。本研究结果将为PRV Bartha-K61生产过程中提供新型高产候选细胞株。根据MLKL序列设计特异性编辑位点,构建质粒MLKL-sgRNA,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选,获得多克隆细胞株,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-/-单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blot验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除效果。采用TCID50方法检测病毒增殖水平。最后,采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。结果表明,筛选出1株MLKL基因缺失647bp的PK-15细胞株,Western blot未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-/-细胞显著提高PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的病毒滴度。PRV Bartha-K61接种24h后,PK-15 MLKL-/-细胞培养上清的病毒滴度提高了约15.8倍;PRV Bartha-K61接种36h后,PK-15 MLKL-/-细胞培养上清的病毒滴度提高了约10.0倍。进一步研究发现,与PK-15细胞相比,PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-/-细胞后,坏死细胞明显减少。根据RIPK3序列设计特异性编辑位点,构建质粒RIPK3-sgRNA,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选,获得多克隆细胞株,通过有限稀释法获得PK-15 RIPK3-/-单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序、间接免疫荧光和Western blot验证RIPK3基因在PK-15细胞上的敲除效果。采用TCID50方法检测病毒增殖水平。最后,采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。结果表明,筛选出1株RIPK3基因缺失3767bp的PK-15细胞株,间接免疫荧光和Western blot未检测到RIPK3蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 RIPK3-/-细胞显著提高PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的病毒滴度。PRV Bartha-K61接种36h后,PK-15 RIPK3-/-细胞培养上清的病毒滴度提高了约4.0倍;PRV Bartha-K61接种48h后,PK-15 RIPK3-/-细胞培养上清的病毒滴度提高了约5.7倍。进一步研究发现,PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 RIPK3-/-细胞后,坏死细胞明显减少。本试验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了MLKL基因缺失的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-/-)和RIPK3基因缺失的PK-15细胞株(PK-15 RIPK3-/-)。PK-15 MLKL-/-细胞株和PK-15 RIPK3-/-细胞株均能够提高PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的增殖和存活能力,但PK-15 MLKL-/-细胞株促进PRV Bartha-K61的增殖的能力更显著。本研究成果有望为PRV Bartha-K61等减毒活疫苗生产过程中提供新型高产候选细胞株,但后续仍然有许多工作需要完善。
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