研究背景恶性黑色素瘤是极具侵袭性的皮肤恶性肿瘤之一,多发于欧美等发达国家。在美国,恶性黑色素瘤分别是发病率第五的男性恶性肿瘤(5%)和发病率第六的女性恶性肿瘤(4%)。对于亚洲国家而言,恶性黑色素瘤的发病率远远低于欧美国家,大部分地区发病率不足1/10万。在中国,恶性黑色素瘤并不是一种十分常见的恶性肿瘤,然而,由于人口基数大,恶性黑色素瘤的总体罹患人数较多,尤其在沿海发达城市,恶性黑色素瘤的发病率和死亡率均呈现快速上升趋势,应引起足够的重视。此外,恶性黑色素瘤是一种早期转移率极高的恶性肿瘤,预后很差,这也是该病致死率高的一个重要原因。恶性黑色素瘤病因复杂,目前已经明确的恶性黑色素瘤致病因素有遗传因素、日光暴露等环境因素以及电离辐射等因素。治疗措施方面,临床上以手术切除治疗为主,辅以免疫疗法、肿瘤靶向药物治疗等综合措施,可改善大部分恶性黑色素瘤患者的疾病进程。然而,上述治疗措施对于转移性恶性黑色素瘤疗效甚微,患者的五年生存率不足20%。因此,寻找新的诊断、治疗手段对于提高恶性黑色素瘤患者的预后具有重要意义。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)家族蛋白及其受体FGFR家族蛋白属于经典的酪氨酸激酶受体-配体信号通路转导蛋白。目前共有22种FGF和4种FGFR被发现和鉴定。FGFR家族蛋白在机体正常的血管形成、胚胎发育等过程发挥重要作用。FGFR3最早被认为是一种骨骼发育的负向调控蛋白,FGFR3敲除的小鼠呈现长骨发育过度的表型,而激活的FGFR3突变则被证实与侏儒症密切相关。近年来,过度激活的FGFR3信号被证实与骨髓瘤、宫颈癌、膀胱癌等恶性肿瘤密切相关,激活型FGFR3突变可以显著增强多种肿瘤细胞的恶性行为,因此FGFR3被认为是多种恶性肿瘤的一个潜在治疗靶点。FGF及其受体与恶性黑色素瘤的发生发展关系密切,FGFR1是决定恶性黑色素瘤原位增生、血管新生和远处转移的一个关键基因。FGFR4与恶性黑色素瘤的恶性程度正相关。考虑到FGFR家族蛋白在结构上的同源性和功能上的相似性,阐明FGFR3在恶性黑色素瘤中的表达情况、临床意义和生物学功能可能具有重要的价值。研究目的1、使用定量PCR技术明确FGFR3在恶性黑色素瘤组织和配对正常组织中的表达量。2、检测FGFR3在恶性黑色素瘤组织中的表达量与患者的临床病理特点之间的关系。3、分别在恶性黑色素瘤细胞中敲低和过表达FGFR3,验证FGFR3对细胞增殖的调控作用。4、验证FGFR3对恶性黑色素瘤细胞的体外迁移、侵袭及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)行为的调控作用。5、探究FGFR3对恶性黑色素瘤细胞体内增殖、迁移的调控作用。6、初步明确沉默FGFR3导致的恶性黑色素瘤细胞信号通路改变。研究方法1、收集恶性黑色素瘤组织及其癌旁组织样本42对,抽提RNA之后,采用荧光实时定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)检测FGFR3在恶性黑色素瘤组织和对应癌旁组织的表达量。2、免疫组化芯片技术检测FGFR3在恶性黑色素瘤组织中的表达量,根据染色强度和阳性细胞数进行评分。染色强度由低到高分为A、B、C、D四个等级,阳性细胞数分为A(<10%)、B(10%-25%)、C(25%-50%)、D(>50%)四个等级。采用染色强度的评分乘以阳性细胞数评分代表每个样本最终的评分,0-3分代表FGFR3低表达,4-9代表高表达。3、采用慢病毒转染技术获得稳定敲低FGFR3的细胞株A375/LV-shFGFR3和对照细胞株A375/LV-control。瞬时转染技术获得高表达FGFR3的细胞株A375/pcDNA3.0-FGFR3和对照细胞株A375/pcDNA3.0,采用qPCR技术分别验证mRNA水平的敲低效率和过表达效率。4、采用CCK-8技术检测FGFR3对恶性黑色素瘤细胞增殖的调控作用。使用适量胰酶消化细胞后,用培养液重悬,反复吹打均匀,将其浓度调整为1000细胞/100微升。各组细胞分别取100ul细胞悬液置于96孔板中,每天相同时刻加入10ul CCK-8,4h后使用酶标仪检测吸光度值,连续检测6天。5、采用流式细胞术检测FGFR3对恶性黑色素瘤细胞凋亡率的影响。A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control细胞经AnnexinV和PI染色后,经流式细胞仪检测其凋亡率差异。6、采用transwell小室和matrigel invasion chambers分别检测FGFR3对恶性黑色素瘤细胞迁移、侵袭的调控作用。7、A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control细胞分别注射入4周龄裸鼠右侧腋下,每周检测肿瘤体积变化,5周后将裸鼠处死,对比两组皮下移植瘤的大小和重量。两组细胞分别经尾静脉注射入裸鼠体内,两个月后对比两组裸鼠肺部转移结节的数目。8、采用Western blot技术检测A375/LV-shFGFR33和A375/LV-control细胞各自的ERK、AKT、EGFR等关键信号通路蛋白及其磷酸化蛋白的表达量。研究结果1、FGFR3在恶性黑色素瘤组织中的表达量显著高于癌旁组织。FGFR3在恶性黑色素瘤组织中的表达量与Breslow厚度和淋巴结转移相关。2、慢病毒干扰FGFR3的表达之后,A375细胞增殖活力降低,质粒过表达FGFR3之后,A375细胞的增殖活力升高。3、沉默FGFR3显著增加恶性黑色素瘤细胞的凋亡率,过表达FGFR3降低其凋亡率。4、慢病毒干扰FGFR3的表达之后,恶性黑色素瘤A375细胞的迁移、侵袭能力降低,而FGFR3表达质粒可增强恶性黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力。5、沉默FGFR3可以显著降低恶性黑色素瘤细胞的体内增殖、迁移能力。6、沉默FGFR3曾加上皮性标志物E-cadherin、Laminin的表达量,降低间充质标志物N-cadherin、vimentin等的表达量。7、沉默FGFR3对ERK、AKT、EGFR等信号通路蛋白的表达量无明显影响,可显著下调ERK、AKT、EGFR等信号通路蛋白的磷酸化水平。研究结论FGFR3在恶性黑色素瘤组织中存在过表达；与恶性黑色素瘤的Breslow厚度和淋巴结转移正相关。FGFR3通过调控p-ERK、p-AKT和p-EGFR的水平调控黑色素瘤A375细胞的恶性生物学行为。