论文部分内容阅读
目的构建过表达KLK7基因的前列腺癌细胞系22RV1-KLK7,利用基于质谱的稳定同位素标记氨基酸细胞培养的定量蛋白质组学方法,检测过表达KLK7的细胞系22RV1-KLK7与对照细胞系之间的差异蛋白,探索KLK7所调控的蛋白表达谱,并进行部分蛋白的实验验证,为阐明KLK7在前列腺癌进展中的生物学功能及作用机制提供蛋白分子基础。方法1、利用质粒转染技术,构建稳定过表达KLK7的细胞系22RV1-KLK7和对照细胞系22RV1-V,并在mRNA和蛋白质水平进行验证;2、22RV1-KLK7细胞培养在含13C或15N标记的赖氨酸与精氨酸培养基中,22RV1-V细胞培养在普通培养基,分别提取两组细胞的蛋白质,定量和变性后进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色、脱水、酶解、提肽、冻干等步骤,采用液相色谱-质谱联用技术对两组样品的蛋白质进行鉴定和定量;3、对两组样品的搜库结果进行差异分析,获得22RV1-KLK7和22RV1-V的差异蛋白谱;4、对以上蛋白集合进行生物信息学分析,寻找差异蛋白所在的主要功能分类、信号通路、相互作用网络等;5、选择差异蛋白中具有生物学意义的候选蛋白,在mRNA和蛋白质水平分别验证;6、选择有生物学意义的候选蛋白,用免疫组织化学染色技术在组织微阵列芯片中检测这些蛋白的表达水平,并与临床特征进行相关性分析,寻找可能影响这些蛋白表达的指标。结果1、本研究成功构建稳定过表达KLK7的细胞系22RV1-KLK7,为后续蛋白质组实验提供了研究对象;2、质谱共定量到2006个蛋白质,有350个差异蛋白(P<0.01,foldchange ratio>1.3或<0.77),其中上调蛋白137个,下调蛋白213个;3、生物信息学分析结果显示,KLK7过表达后上调蛋白功能分类主要集中在分解代谢、对化学刺激的响应、应激反应、对凋亡的负调控、骨架蛋白介导的过程等功能分类中,下调蛋白的主要功能分类集中在新陈代谢过程、生物合成、氧化还原等;4、本研究选择了AGR2和TST两个上调蛋白进行实验验证,结果显示22RV1-KLK7的AGR2和 TST 的 mRNA 水平相比 22RV1-V 显著提高(21.8±6.31 VS 1.21 ± 0.21,P<0.01; 36.7±7.23VS 1.09±0.16,P<0.01),AGR2和TST蛋白的表达水平在22RV1-KLK7中显著升高;5、AGR2和TST蛋白在前列腺癌组织中高度表达,在BPH或正常前列腺组织不表达或低表达,提示其可作为前列腺癌的候选分子标志物。结论1、本研究成功构建了过表达KLK7基因的前列腺癌上皮细胞系22RV1-KLK7; 2、首次建立了 KLK7蛋白在22RV1细胞系中调节的蛋白表达谱,并初步分析了这些蛋白的生物学功能,认为KLK7蛋白的上调促进肿瘤细胞的侵袭与转移;3、验证了 22RV1-KLK7细胞系中AGR2和TST转录和表达水平的升高,证实了蛋白质组实验结果的可靠性;4、在临床样本切片标本中进一步探索了 AGR2和TST蛋白的表达水平,发现了 AGR2和TST在前列腺癌组织中比正常和良性增生组织表达升高,并且AGR2水平与肿瘤大小和浸润程度相关。