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目的1.研究男性肝癌中TSPY1对AR表达的调控作用。2.研究男性肝癌中TSPY1调控AR表达的机制。方法1.采用TRIzol 一步法提取各肝癌细胞总RNA,qRT-PCR检测在肝癌细胞中AR和TSPY1基因表达水平;提取细胞总蛋白,Western Blot检测在肝癌细胞中AR和TSPY1蛋白表达水平。2.以TSPY1基因的CDS区域为模板设计合成TSPYlcDNA序列,构建TSPY1过表达慢病毒载体,在Huh7细胞中利用慢病毒载体感染技术过表达TSPY1基因,以空转染绿色荧光蛋白(GFP)的对应肝癌细胞作为对照。感染48h后,利用流式细胞仪检测感染效率。收集细胞后,采用TRIzol 一步法提取Huh7细胞总RNA,qRT-PCR检测TSPY1、AR的基因表达水平;提取Huh7细胞总蛋白,Western Blot检测TSPY1、AR的蛋白表达水平及MAPK信号通路相关信号分子(JNK、ERK1/2、p38)的表达及磷酸化水平。3.以TSPY1基因的CDS区域为模板设计合成shRNA序列,构建TSPY1-shRNA干扰慢病毒载体,应用RNA干扰技术沉默HCCLM3细胞中TSPY1的表达,以空转染GFP的对应肝癌细胞作为对照;感染48h后,利用流式细胞仪检测感染效率。收集细胞后,采用TRIzol一步法提取HCCLM3细胞总RNA,qRT-PCR检测TSPY1、AR的基因表达水平;提取HCCLM3细胞总蛋白,Western Blot检测TSPY1、AR的蛋白表达水平及MAPK信号通路相关信号分子(JNK、ERK1/2、p38)的表达及磷酸化水平。4.以转染空载体Huh7细胞作为对照,在TSPY1过表达Huh7细胞中,加入或不加入MAPK/ERK信号通路抑制剂(U0126),提取各实验组Huh7细胞总蛋白,Western Blot检测AR蛋白表达水平以及ERK1/2磷酸化水平。结果1. TSPY1和AR均在Huh7等不转移或低转移潜能的肝癌细胞中低表达,在HCCLM3等高转移潜能的肝癌细胞中高表达,并且两者无论是基因水平还是蛋白水平均呈高度正相关变化。2.过表达TSPY1的Huh7细胞中,AR的mRNA和蛋白表达水平均升高。MAPK信号通路相关信号分子JNK和p38磷酸化水平不变,ERK1/2磷酸化水平明显升高。3.沉默TSPY1表达的HCCLM3细胞中,AR的mRNA和蛋白表达水平均降低。MAPK信号通路相关信号分子JNK和p38磷酸化水平不变,ERK1/2磷酸化水平明显降低。4.过表达TSPY1的Huh7细胞中不加入或加入MAPK/ERK信号通路抑制剂(U0126),加入抑制剂实验组的AR蛋白表达水平降低。结论1、肝癌细胞中TSPY1和AR呈高度正相关。2、过表达和沉默TSPY1,检测AR和MAPK信号通路关键分子及磷酸化水平。过表达TSPY1的Huh7细胞中MAPK/ERK磷酸化水平明显升高,AR表达也随之增加;沉默TSPY1表达的HCCLM3细胞中MAPK/ERK磷酸化水平明显受到抑制,AR表达也随之降低。说明TSPY1可能通过活化MAPK/ERK信号通路调控AR的表达。3、在TSPY1过表达的Huh7细胞中抑制MAPK/ERK信号通路,检测到AR的表达降低,更进一步证明了 TSPY1可能通过MAPK/ERK信号通路调控AR的表达。这一发现能为阐明TSPY1调控AR促进男性肝癌的发生发展提供理论依据。