中药注射剂是将现代制剂工艺与传统中医药理论相结合而发展起来的中药新剂型，其不但具有注射剂起效快、作用强的优点，又在一定程度上保留了中医药特色，因此在临床上得到了广泛应用。然而近年来不断曝光的中药注射剂严重不良反应事件，使整个中医药事业遭受了巨大冲击。由于目前临床使用的中药注射剂绝大多数是二十世纪80年代以前开发的品种，受当时的研发技术条件、仪器设备等多因素制约，中药注射剂仍存在很多问题没有解决，如成分复杂、生产工艺落后、质量标准要求低、过敏试验不敏感以及临床用药不合理、缺乏上市后再评价体系等等，这些因素共同造成了目前中药注射剂不良反应频发的现状。因此，通过对中药注射剂进行全面再评价研究，寻找其中的有害成分，提高生产工艺、质量标准，建立上市后再评价体系等手段，全面提高中药注射剂的临床用药安全性就成为目前亟待解决的问题。 鱼腥草注射液是上世纪七十年代研制开发的清热解毒类中药注射剂，是由鱼腥草鲜品经双蒸馏提取后加入适量增溶剂吐温80而制成，其主要成分为甲基正壬酮、癸酰乙醛、癸醛、月桎醛等，现代药理研究表明其具有抗病毒、抗菌、抗炎、解热、镇咳，增强机体免疫力及抗过敏等多种功效，临床广泛用于呼吸系统、泌尿系统等感染性疾病。经过三十余年基础和临床的研究和应用，鱼腥草注射液因其良好疗效及低耐药性，在临床上得到了广泛应用和认可，被称为“中药抗生素”。在我国抗击非典和禽流感等重大疑难疾病的关键时刻，该药都被列入卫生部推荐用药名单中，具有难以替代的作用和地位。然而2006年的“鱼腥草事件”使鱼腥草注射液的临床安全性问题暴露出来。国家药品不良反应监测中心监测数据显示：含鱼腥草的7个注射剂品种，1988～2006年发生不良反应病例5000多例，其中严重不良反应222例，死亡35例，引起的不良反应主要为过敏性休克、全身过敏反应和呼吸困难等。因此2006年6月1日，国家药品食品监督管理局发布紧急通告，在全国范围内暂停使用和审批7类鱼腥草注射剂。在此之前，我国有近200家鱼腥草注射剂生产企业，年产量达6亿支，患者使用量达2.8亿人次，年产值接近百亿元。据不完全统计，此次叫停已导致大部分以鱼腥草注射剂产品为主的生产企业面临倒闭，数万名员工已经或正在面临失业，数十万种植鱼腥草的农民将失去经济来源。鱼腥草的种植、加工、提取、成药等整个产业链的价值近百亿元的损失正在形成。因此，对鱼腥草注射液导致临床不良反应的原因进行全面分析研究，改进工艺，消除其中有害成分，从而使其重新恢复生产和使用是目前亟待解决的重大问题。 因此，本课题以中药注射剂中出现严重不良反应的代表性药物鱼腥草注射液为研究对象，从药物生产工艺和辅料两个方面对其导致临床不良反应的原因进行分析研究，以期找到其中的有害成分/致敏原，并对其致敏机制进行初步探讨。在明确鱼腥草注射液中的毒性成分后，对其生产工艺进行改进研究，以消除有害物质，降低不良反应，为鱼腥草注射液重新恢复生产和使用提供科学依据。此外，本研究还针对目前中药注射剂临床前致敏性评价高阴性结果与临床高阳性结果的不相关性问题进行了初步探讨，通过对实验动物的优选及致敏剂量的优化，以期为提高临床前致敏性评价的敏感性和准确性提供实验基础。 一、鱼腥草注射液毒性成分分析 1、本研究采用Beagle犬全身主动过敏试验方法对鱼腥草双蒸馏液和增溶剂吐温80的致敏性进行了评价，结果发现单独使用鱼腥草蒸馏液静脉输注并不会引起Beagle过敏反应，而输注含1％吐温80鱼腥草蒸馏液后Beagle犬出现严重过敏反应症状，伴有血清组胺水平升高。结果表明鱼腥草注射液中的主要致敏物质是其中的增溶剂吐温80，且由于首次输注即可引起犬明显过敏反应，因此其导致的过敏反应类型应属于类过敏反应； 2、通过对鱼腥草双蒸馏液(双蒸馏法提取)和鱼腥草提取物(水煮醇沉法提取)对小鼠静脉急性毒性的比较研究发现，鱼腥草提取物的静脉用药急性毒性远高于鱼腥草双蒸馏液，因此难以保证临床静脉用药的安全性，不适合进行鱼腥草注射液的生产。而部分药厂使用不符合部颁标准生产工艺的水煮醇沉提取物做为原料药进行注射液的生产，这也是导致鱼腥草注射液临床不良反应的原因之一。 二、鱼腥草注射液增溶剂吐温80致敏机制研究 1、本研究通过使用不同浓度的吐温80溶液与RBL—2H3细胞体外共孵育的方法，观察吐温80对RBL—2H3细胞的直接诱导脱颗粒作用。结果显示250、1250、6250mg·L-1吐温80溶液均可以导致RBL—2H3细胞的组胺和β—氨基己糖苷酶释放率呈浓度依赖性增加；Annexin—Ⅴ荧光染色检测(流式细胞仪检测和荧光显微镜观察)发现此3个浓度吐温80可以导致RBL—2H3细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻呈浓度依赖性增加；使用含钙与不含钙缓冲体系进行孵育，发现β—氨基己糖苷酶释放率没有显著性差异。此结果说明吐温80可以在不依赖IgE抗体的情况下直接诱导肥大细胞脱颗粒，释放活性介质，且此诱导作用不依赖细胞外游离钙离子的存在，与IgE介导的肥大细胞脱颗粒过程明显不同； 2、本研究还通过吐温80与健康人血清体外振荡孵育的方法，观察吐温80对人补体系统的激活作用，ELISA方法测定反应体系中SC5b—9，C4d，Bb含量以观察补体系统激活情况及可能的激活途径。结果显示，与吐温80共孵育后，12个血清样本中的10个反应体系中SC5b—9含量明显上升，说明吐温80确实可以导致人补体系统激活，且进一步实验证明此种激活作用与吐温80的剂量和作用时间成正相关。另外，7个血清样本与吐温80孵育后Bb含量均有明显上升，而C4d含量未见显著性改变，该结果提示吐温80激活人补体系统可能是通过激活旁路途径实现的。 综上所述，吐温80导致类过敏反应的发生是多条途径共同作用的结果，目前研究发现其与以下两个方面密切相关：①在不依赖IgE抗体的情况下，直接诱导肥大细胞脱颗粒，释放活性介质；②通过旁路途径激活人补体系统，进一步产生过敏毒素，刺激肥大细胞释放活性介质。其具体作用机制尚有待进一步研究。 三、优选鱼腥草注射液增溶剂研究 通过对几种增溶剂静脉急性毒性、致敏性、溶血性、血管刺激性的比较，结果显示羟丙基-β—环糊精静脉用药的安全性较高，且通过药学研究发现0.2％(W/V)浓度即可以对鱼腥草注射液中的难溶性成分进行有效增溶，因此有希望取代吐温80成为鱼腥草注射液新的增溶剂。而其是否确可用于鱼腥草注射液的生产，尚有待完善生产工艺后对新制剂进行毒理、药理等方面的全面评价。 四、改进经典致敏实验研究 通过对Beagle犬、小鼠、家兔、豚鼠、BN大鼠，以及感染/发热模型豚鼠对吐温80致敏性的敏感性比较，得出以下结论：①在对中药注射剂进行致敏性评价时首选实验动物为Beagle犬和豚鼠，二者可以互为补充；②对于清热解毒类中药注射剂来说，使用符合临床实际情况的发热动物模型进行致敏性评价更为适宜；③观察指标方面，除过敏反应症状外，血清免疫学检查可以为致敏性评价提供更为客观的辅助指标；④试验方法方面，选择在首次给药即采用静脉注射的方式，可以在同一试验过程中同时观察类过敏反应和过敏反应；⑤而适度提高给药剂量可以提高致敏试验的敏感性和准确性。 另外，体外诱导RBL—2H3细胞脱颗粒试验和体外激活人血清补体系统试验可以做为致敏试验的补充试验加入到中药注射剂的致敏性评价体系中，从而为药物致敏性评价提供更为全面的临床前依据。 本研究的创新点主要包括以下三个方面： 1.通过多种动物、方法和指标，证实鱼腥草注射液中主要致敏物质是增溶剂吐温80，并对其致敏机制从直接诱导肥大细胞脱颗粒和激活人补体系统两个方面进行了探讨； 2.通过多种增溶剂比较研究，初步优选出相对安全、高效的注射用增溶剂，并发现以其配制的鱼腥草注射液基本可以控制类过敏反应的发生，为鱼腥草注射液提高安全性、恢复生产，奠定了基础； 3.通过改进致敏实验，建立准确、特异、敏感的新方法，为解决中药注射剂的一些关键共性问题提供了新方法及理论依据。