乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在我国其发病率呈逐年上升的趋势。在肯定化疗效果的同时，我们不得不承认肿瘤细胞产生的针对多种药物的耐药现象是乳腺癌治疗失败的重要原因。随着microRNA在肿瘤发生和耐药研究的不断深入，microRNA已经成为生命科学研究的焦点，并取得了一定的进展。我们通过生物信息学分析预测了可能参与乳腺癌多药耐药的microRNA分子，基于分子克隆相关技术构建了慢病毒表达载体，利用双荧光素酶报告基因系统、Western Blot和细胞转染等分子生物学相关实验筛选出参与乳腺癌耐药的microRNA分子，并进一步分析了其可能的相关作用机制，为有效逆转乳腺癌耐药和提高乳腺癌的临床化疗疗效提供了新的思路。研究可分为三部分：第一部分：乳腺癌过表达MDR1稳转细胞系和乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞系的建立。在乳腺癌治疗中，多药耐药现象产生的主要原因之一是MDR1基因的过表达，我们通过分子克隆技术成功在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中建立了多药耐药基因MDR1的稳转细胞株。慢病毒载体作为基因转导工具，相比逆转录载体最大的优势是可以同时感染分裂和非分裂期的细胞。通过将外源性基因整合入宿主细胞基因组，使得目的基因获得长期稳定的表达。慢病毒感染的靶细胞范围很广，包括神经元、淋巴细胞和巨噬细胞等多种类型。上述优点使得慢病毒在基础研究及基因治疗领域都具有广阔的应用前景。通过Invitrogen公司Gateway核心技术将含有全长MDR1基因的入门载体成功重组入慢病毒骨架载体pLenti6.3/V5-DEST。为了使外源基因MDR1能在MDA-MB-231和MCF-7细胞中稳定持续表达，应用第二代慢病毒包装系统包装病毒，并转染人胚肾293T细胞，在靶细胞中获得高达90%以上的感染率。为获得MDR1稳定整合的细胞，通过4周的灭瘟素（Blasticilin10μg/ml）筛选，最终建立稳定的MDR1基因过表达的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株。研究结果显示，MDR1基因及其编码的蛋白可增强乳腺癌细胞多药耐药能力。另一方面，为了获得乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株，我们选择了MDA-MB-231乳腺癌细胞作为靶细胞。通过10个月的持续剂量多西紫杉醇维持筛选（2μM），我们获得了稳定的多西紫杉醇耐药细胞系。为深入研究乳腺癌的多西紫杉醇耐药机制奠定了良好的实验基础。第二部分：作用于靶基因MDR1的候选miRNA分子慢病毒载体的构建和筛选。通过生物学信息分析，我们预测出以MDR1基因作为靶基因的五种miRNAs，并成功构建了其慢病毒表达载体。利用双荧光素酶报告基因系统、Western Blot、细胞增殖-毒性实验等方法，发现miR-129参与了乳腺癌多西紫杉醇耐药的过程。第三部分：miR-129参与乳腺癌多西紫杉醇耐药的机制研究及其对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响。为了深入研究miR-129在乳腺癌多西紫杉醇耐药中的作用，我们成功构建了MDA-MB-231/miR-129和MCF-7/miR-129过表达稳转细胞系，Real-time PCR结果显示miR-129-3P在MDA-MB-231/miR-129和MCF-7/miR-129细胞中高表达。同时发现，miR-129-3P在多西紫杉醇耐药细胞系MDA-MB-231-R中也呈高表达状态。在MDA-MB-231和MCF-7细胞中过表达miR-129后，细胞增殖-毒性实验验证了miR-129可促进乳腺癌细胞获得耐药性。平板克隆实验和EdU染色检测结果显示miR-129可发挥促进乳腺癌细胞增殖的作用。在MDA-MB-231细胞中转染化学合成的miR-129-3P minics和在其耐药细胞中转染miR-129-3P inhibitor后，结果显示miR-129-3P的高表达可增强乳腺癌细胞的耐药性，为进一步深入研究miR-129参与乳腺癌耐药的分子机制奠定了一定的基础。