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日本血吸虫(Schistosoma japonicum)隶属于扁形动物门(Platyhelmeinthes)、吸虫纲(Trematoda)、复殖目(Digenea)、裂体科(Schistosomatidae)、裂体属(Schistosoma)。血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。日本血吸虫为雌雄异体,性别的分化对血吸虫的发育及致病起着至关重要的作用,成熟雌虫所产生大量虫卵而引起肝脏病变是造成宿主主要病理损害和疾病再传播的前提。基于此本论文运用表达谱芯片技术,开展了日本血吸虫性别差异表达基因的筛选,本试验对性别差异表达转铁蛋白基因功能进行了一系列研究,包括该基因的克隆表达、不同期别虫体的表达时相、免疫学研究及血吸虫体内该蛋白的免疫组织定位分析。并成功克隆、表达了转铁蛋白重链差异表达基因,且对该蛋白的免疫保护性、免疫组织定位和虫期特异性等进行深入的分析.以探索血吸虫性别发育的分子机理,开拓免疫预防新途径。主要研究结果如下:
1、通过1.5万个cDNA序列的寡核苷酸血吸虫基因芯片分析,共获得1459个成熟雌虫高表达基因,1019个成熟雄虫高表达基因。对所获得的基因进行GO功能分类,显示日本血吸虫雌、雄虫高表达基因的蛋白多为结合活性、催化活性、运输活性、分子转换活性、结构分子活性、酶调节活性、电子载体活性、转录调节活性和翻译调节活性等9类,其中雄虫高表达基因无翻译调节活性。信号通路分析表明,雌、雄虫参与的通路基本无差异,参与基因种类最多的是新陈代谢通路,包括糖酵解途径、柠檬酸循环途径、丙酮酸途径、氧化磷酸化、氮代谢、甘油磷酸酯途径、嘌呤代谢、嘧啶代谢、脂肪酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢等。选取1个产卵过程基因、2个高铁结合基因和2个P450共5个差异表达基因进行实时定量PCR验证,结果和芯片基本相符,高铁结合基因表达量明显高于产卵过程基因和P450基因。
2、以42d成虫cDNA文库为模板,克隆获得了转铁蛋白重链基因(Sjfer-1 hc)。ORF为522bp,编码174个氨基酸,编码蛋白没有跨膜区,N端不含有信号肽,不是分泌蛋白。构建的重组表达质粒pET28a(+)-Sjfer-1 hc在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot和ELISA分析表明重组蛋白具有较好的反应原性。通过小鼠免疫保护试验显示,减虫率为16.5%、减雌率为13.3%、肝脏减卵率为32%和减毛蚴孵化率为27.06%。免疫组织化学定位分析表明,SjFer-1 hc蛋白主要分布在童虫和成虫的吸盘和体壁肌肉组织,随着血吸虫的发育成熟,SjFer-1 hc蛋白在28d雄虫精巢也有大量分布。
3、SjFer-1 hc抗原虫期特异性结果表明,童虫期(7d、14d和18d)和成虫期(21d、26d和35d)均检测到Sjfer-hc的mRNA,童虫期在18d转录量达到最高。成虫期21d表达量较低,35d高表达。成虫期21d、26d和35d雌虫表达量均高于雄虫,雌虫在26d表达量最高,后期逐渐下降。以SjFer-hc蛋白诱导宿主产生抗体并通过酶联免疫吸附检测,显示感染后14d特异性IgG抗体P/N值大于2.0,说明SjFer-1 hc蛋白在血吸虫早期就有表达,具有早期诊断价值。