论文部分内容阅读
背景与目的紫杉醇(Paclitaxel)是由Wani等1971年从短叶红豆杉的树皮中分离得到而命名，具有独特的抗微管作用，能促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚，阻碍细胞内骨架的合成，从而干扰有丝分裂。主要用于研究治疗乳腺癌、前列腺癌及非小细胞肺癌等。紫杉醇是一种水不溶药物，溶解性问题是紫杉醇制剂的首要问题。另外，紫杉醇作为细胞毒性的抗肿瘤药物，因为缺乏肿瘤靶向性，将导致全身性毒性，特别是中性粒细胞减少症等免疫性疾病，这使得临床应用受到很大限制。单壁碳纳米管(Single-walled Carbon Nanotubes，SWCNTs)具有中空结构与极大的表面积，使其能够与蛋白质、核酸和药物等多种有机分子或无机离子相结合。SWCNTs具有独特的跨膜能力，能够被动穿过多种细胞膜，成为一种新型的非病毒基因药物载体。研究表明，NGR(N：天冬酰氨酸，G：氨基乙酸，R：精氨酸)，能够与肿瘤细胞及新生血管特异性结合，是具有肿瘤靶向性的多肽分子。本研究的目的是利用氨基酸和表面活性剂将SWCNTs分散在水中，将紫杉醇通过非共价作用吸附到SWCNTs的表面，通过DSPE-PEG-Maleimide再连接NGR实现主动靶向，构建以碳纳米管为基体的紫杉醇纳米靶向转运系统NGR-SWCNTs-Paclitaxel。探讨NGR-SWCNTs-Paclitaxel对离体细胞的影响，并观察NGR-SWCNTs-Paclitaxel对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用，为肿瘤的靶向治疗提供理论和实验依据。本研究分为以下四部分。第一章紫杉醇靶向制剂的处方前研究方法1.高效液相色谱法分析法进行Paclitaxel含量测定。2.分光光度法进行SWCNTs含量测定。3.所获数据采用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析，结果以均数±标准差（±SD）表示，P<0.05表示有统计学差异，P<0.01表示差异显著。结果Paclitaxel1在1~40μg/ml范围与峰面积线性关系良好， SWCNTs在2~160μg/ml范围与吸光度线性关系良好，精密度与回收率试验结果均符合方法学要求。第二章紫杉醇靶向制剂的制备方法对NGR-SWCNTs-Paclitaxel及其冻干粉制剂和制备条件进行了研究；通过单因素实验考察了投料比、表面活性剂的种类、探超功率和次数等因素对载药率与包封率的影响，确定了SWCNTs-Paclitaxel的制备方法，并进一步连接靶向基团NGR。结果制备了NGR-SWCNTs-Paclitaxel转运载体，其平均粒径181nm，Zeta电位为-23mv。第三章紫杉醇靶向制剂的体外活性研究方法以MCF-7乳腺癌细胞为主要实验对象，研究了NGR-SWCNTs-Paclitaxel体外对肿瘤细胞的作用。1.通过FITC标记NGR-SWCNTs-Paclitaxel，荧光显微镜下观察细胞，记录MCF-7乳腺癌细胞对其体外摄取。2. MTT法、流式细胞术等研究NGR-SWCNTs-Paclitaxel对肿瘤细胞的生长抑制作用，及其对细胞周期及凋亡的影响。结果1. MCF-7乳腺癌细胞能够有效吞噬NGR-SWCNTs-Paclitaxel复合物，在1h之内，NGR-SWCNTs-Paclitaxel可透过MCF-7乳腺癌细胞膜转运到细胞内部。并随着时间的延长摄取复合物的量也增加。2. NGR-SWCNTs-Paclitaxel明显抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖(P<0.05)，并且这种抑制具有剂量依赖性和时间依赖性；NGR-SWCNTs-Paclitaxel能诱导细胞凋亡，并产生G2/M期阻滞。第四章紫杉醇靶向制剂的体内活性研究方法1.以SD大鼠为模型动物，采用HPLC测定Paclitaxel在大鼠血浆中的浓度，研究NGR-SWCNTs-Paclitaxel体内药物动力学。2.以S180荷载肉瘤小鼠为模型动物，HPLC测定Paclitaxel在各组织中的浓度，考察NGR-SWCNTs-Paclitaxel在各器官及其瘤组织的分布，同时考察NGR-SWCNTs-Paclitaxel及Paclitaxel对照制剂对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用。结果1.与Paclitaxel对照相比，NGR-SWCNTs-Paclitaxel在SD大鼠体内具有一定的缓释作用，平均滞留时间延长一倍。2.与Paclitaxel对照相比，NGR-SWCNTs-Paclitaxel在S180荷载肉瘤小鼠肝、肺、脾、肾及肿瘤组织中的药物浓度增加。3.较Paclitaxel对照制剂相比，NGR-SWCNTs-Paclitaxel对S180肉瘤小鼠有更强的抑瘤作用（P<0.05）。结论1.成功制备了NGR-SWCNTs-Paclitaxel靶向制剂。2. NGR-SWCNTs-Paclitaxel可透过MCF-7乳腺癌细胞膜转运到细胞内部。3. NGR-SWCNTs-Paclitaxel对MCF-7乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用，能诱导细胞凋亡，并产生G2/M期阻滞。4. NGR-SWCNTs-Paclitaxel在SD大鼠体内具有一定的缓释作用。5. NGR-SWCNTs-Paclitaxel具有明显的肿瘤和肝靶向性。6. NGR-SWCNTs-Paclitaxel对S180肉瘤小鼠有明显的抑瘤作用。